DDNNAA条形码技术及其在动物物证鉴定中的应用

马艳君 周用武 黄娅琳

野生动植物是地球自然资源的重要组成部分，具有很高的生态意义，并包括了科学、文化、经济在内的多方面价值。然而，随着人类文明的不断发展和社会的进步，野生动物的栖息地已经并仍在被人类不断侵蚀，加之动植物资源过度消耗，全球动植物资源总量下降较快。由于高额利益驱使，近年来，非法野生动植物及其制品贸易犯罪链条已相当完备，犯罪手法不断变换，破坏野生动物资源的违法犯罪活动仍屡禁不止，野生动植物及其制品的非法贸易已成为继毒品、武器之后的世界第三大非法贸易。为了规范管理涉及动植物的经济活动，打击违法犯罪行为，保护野生动植物资源，在规范管理和保护执法的过程中，必然要对涉及的动植物进行物种鉴定。

公安及相关部门侦办动物案件时，常会遇到部分犯罪嫌疑人为逃避检查和法律制裁，对动物尸体进行剥皮、肢解、掩埋、蒸煮或焚烧、深加工等，这使得涉案动物丧失了其宏观形态学特征，常规形态学检验的方法不适用于这些上述检材的鉴定。在这种情况下，就要利用微观的分子生物学技术对相关检材进行鉴定。采用DNA条形码（DNA Barcoding）技术鉴定动物物种是近年来物种识别中最为热门并发展最快的一项DNA分析技术，本文对DNA条形码技术及其在打击动物犯罪中的动物物证鉴定应用进行了概述。

一、DNA条形码技术与形态学分类技术的比较

2003年，Hebert等将分子方法拓展至生物物种分类应用中，正式提出DNA条形码的概念。DNA条形码技术是一种建立在DNA序列标记技术及相关的系统发育和分类研究基础上的物种鉴定方法，所用的DNA片段具有物种内特异性和物种间的多样性，能够快速、准确地对物种进行鉴定，类似于通过扫描商品条形码识别具体商品种类的过程。由于DNA条形码技术快速和容易操作，弥补了传统分类学的缺陷，有利于发现新物种，具有巨大的科学应用潜力，在其他学科领域的研究中也得到了一定的应用。

物种鉴定是一项很艰巨的任务。Mora C等的研究预测动物种类数将达到777万种，而已经描述和分类的生物有约953430种，更多的物种还有待人类去发现和分类；研究还表明，陆地上约有86%、海洋中约有91%的物种还没有被人们发现和分类。然而目前关于物种鉴定最常用的形态学分类法却存在着难以克服的缺陷：动物的表型可塑性（Phenotypic plasticity）和遗传可变性（Genetic variability）容易导致鉴定的错误，且许多群体中普遍存在的隐存分类单元也无法用常规形态分类法进行鉴定；生物性别和发育阶段也会影响传统形态鉴定方法，导致很多生物无法被准确鉴定。此外，分类学家的识别能力也有局限性。形态学鉴定的局限性和不断缩减的分类学家队伍，使分类学的发展面临巨大的挑战。

21世纪初分子生物学的巨大进步以及海量生物分子遗传信息的互联网共享为上述问题提供了一个解决方法。DNA条形码技术在从病毒、细菌、原生动物到脊椎动物等高等生物的识别中均有极佳表现，可以很好地识别生物的多样性。在高等生物识别中，通过分析动物线粒体特定基因片断序列就能鉴定该物种的技术，已经在物种多样性调查中得到了广泛应用，积累了大量的文献和数据。这促进了以DNA序列作为生物物种鉴定平台的发展。DNA条形码技术可以快速识别物种的局部组织，鉴定不受物种发育阶段以及个体形态特征的影响，不受物种的限制，并且有利于发现新种和隐存种。此外，该技术的准确度高，操作简单易行，易于掌握和推广。

二、用于动物种属鉴定的DNA条形码基因

作为DNA条形码的序列应具备以下特征：一方面必须具有可区分物种的变异，同时要具有相对的保守性，种内变异要尽量小；二是其两端要同相对保守的引物连接，以便设计通用引物；三是目标DNA片段应相对较短，以便于DNA的提取和扩增。

应用于动物界的DNA条形码主要有线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）基因和核DNA（nuclear DNA，nDNA）基因。其中，mtDNA分子具备结构简单、严格的母系遗传、无重组、与核基因组无共同序列、进化速率快、多拷贝及分子钟理论等优点，比nDNA更容易检测，更容易受遗传漂变的影响，并具有广泛的种内和种间多态性，亲缘关系相关或相近的物种都能得到区分和鉴定。mtDNA分子标记有很多，常被用作动物种属鉴定的mtDNA基因有：线粒体细胞色素氧化酶1基因（Cytochrom-Oxidase I，CO I）、细胞色素b基因（cytochrome b，cyt b）、12S核糖体核糖核酸基因（ribosomal RNA，rRNA）、16S核糖体核糖核酸基因基因、线粒体DNA控制区（Displacement Loop Region，D-loop）、线粒体NADH脱氢酶基因（NADH Dehydrogenase，ND）等。此外，简单重复序列（Simple Sequence Repeats，SSR）或短串联重复序列（short tandem repeats，STR）基因座、单核苷酸多态性标记（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）等核基因也被用于物种鉴定，并常用于动物个体识别和亲权鉴定。

由于DNA检材的状况、基因组变异率、目的DNA片段的长度和完整性等都会影响到检材PCR扩增的结果，因此，在对不同检材进行DNA鉴定时，可依据检材的状况来选择合适的目的基因。例如，野生动物类案件中的涉案生物检材常为各种体液和组织，又经常处于阴暗潮湿、高温或是日照强烈的露天环境，也常混杂污染物，很容易发生变质、降解、腐败，DNA容易断裂。对于这类的检材，应选取小片段目的基因作为DNA条形码。由于在对目的基因的PCR扩增产物进行测序并比对时，物种信息依赖于GenBank等数据库中的关于该物种的信息量和准确性，因此，在选择目的基因时，应尽量选择生物信息丰富的基因。例如，cyt b基因拥有合适的进化速率和长度，是目前为止Genbank数据库中线粒体基因研究数据最多并且在脊椎动物中被测序得最广泛的基因，能充分满足物种鉴定的要求，适合用于物种的DNA鉴定。此外，还应选择合适的DNA提取方法，以保证获得质量较好的DNA。

三、DNA条形码技术在动物物证鉴定中的应用

我国素有食用、药用、衣用、饲养和观赏野生动物或其制品的传统。改革开放以来我国经济社会快速发展，各方面对野生动物的需求十分巨大，合法来源产品难以满足需求。这促使了在一段时期内，非法狩猎或杀害珍贵野生动物以及非法收购、运输、出售走私珍贵野生动物或其制品等犯罪活动愈演愈烈，使得生物多样性和生态平衡遭到破坏和威胁，并可能导致偷漏税费和疫病传播等严重后果，危及国人健康，甚至影响中医药的可持续发展，使国家和民族形象受损。DNA条形码技术是物种鉴定的有力工具，在打击动植物犯罪中也起到了重要的作用。以笔者所在鉴定中心为例，近年来，DNA鉴定在动物物种鉴定中所占比例呈明显上升趋势，DNA条形码技术可用于野生动物保护、中药资源保护、食品安全监测、动物亲子鉴定和个体识别、澄清案件性质等多个方面。

（一）动物种属和种群鉴别

mtDNA在动物种属鉴定方面有着很好的应用。例如，我国新疆地区分布有北山羊、高鼻羚羊、盘羊、岩羊、黄羊、鹅喉羚、马鹿、驼鹿、狍等多种国家重点保护野生动物，同时牧民也有饲养家山羊、绵羊等牲畜。各种“羊”“羚”“鹿”在被去除了角、头、蹄等特征性部位，并被剥皮、肢解后，很难区分。如果不能对涉案样本进行准确的鉴定，会对案件的性质和案件侦破的方向造成重要影响。北山羊和家山羊同属偶蹄目牛科山羊属物种，亲缘关系较近。笔者所在课题组研究发现，利用cyt b基因就可以很好的区分北山羊和家山羊这两个不同物种。

2017年1月1日新修订的《中华人民共和国野生动物保护法》第二十八条规定了“对人工繁育技术成熟稳定的国家重点保护野生动物的人工种群不再列入国家重点保护野生动物保护名录，实行与野外种群不同的管理措施”的管理办法；在2017年7月1日公布实施的第一批《人工繁育国家重点保护陆生野生动物名录》中，就包括了梅花鹿、马鹿等国家重点保护动物。正确区分国家重点保护野生动物的人工种群和野外种群，是查明野生动物产品来源、界定案件性质、防止非法来源的野生动物产品流入合法渠道的重要环节之一。研究表明，mtDNA的D-loop区有着较高的进化速率，能较好地区分动物亚种和不同来源的种群，为动物种群鉴定提供可靠的依据。

（二）动物制品种属来源鉴定

以往各海关口岸对犀牛角、羚羊角等角制品的动物种属来源鉴定主要依赖于形态学方法，在某些情况下经过训练的技术人员使用关键的形态学特征就能进行常规鉴定工作，但大多数情况需要经验丰富的分类专家，如果样本经过人为加工、改造，使原动物制品失去了其关键形态特征，就会使分类专家很难对其进行准确鉴定。此外，形态鉴别特征常有的趋同和变异会导致物种间的鉴定误差。DNA条形码技术一定程度上能够解决这个问题。由于特定的物种具有特定的DNA短片段序列信息，实际工作中，即使所需检定的动物制品形式多种多样、经过加工后的制成品与原来的形态有很大差别，绝大多数情况下DNA条形码技术也能很好地实现对不同形式的动物制品的鉴定。由于DNA技术是可机械重复的，通过一套简单实验技术，经过简单培训的技术员即可操作。这样的工作可投放到基层单位，且准确性高。

（三）混合肉制品鉴定

肉制品中动物源性成分的鉴定对野生动物保护、打击食品掺假造假、保障消费者知情权均具有重要作用。由于食品中肉类经过加工过程后，常会改变原有的形态学特征、质地、气味等，这增加了品种鉴定的困难。利用mtDNA特异性引物，能够分析动物种类；结合复合PCR技术，用多对引物同时对多个基因目标区域进行扩增，可实现对肉制品中混合动物源性成分的区别和鉴定，准确高效，便于推广。

（四）动物个体识别与亲权鉴定

在我国走私、非法猎捕、杀害、收购、运输、出售珍贵濒危陆生野生动物重大案件、特别重大案件立案标准中，都涉及对保护动物数量的确定，而在涉及已肢解动物、动物制品的案件中，就很难通过常规的形态以及痕迹特征确定具体动物数量，这就对相关案件的立案、判决及后继处理造成很大影响。STR和SNP在动物个体识别与亲权鉴定方面的应用，就能很好地解决上述问题。

DNA条形码技术将使执法、科研、检疫检验工作更加高效，使过去专家才能掌握的知识更好地服务于大众与社会。DNA条形码技术能够准确、快速地实现对动物源性成分的鉴定，为动物鉴定提供一种快速、灵敏的新方法，对相关监管部门、各检验机构对动物及其制品进行实际检测研究提供了方法指导和技术支持，能够弥补传统检测方法的缺陷，并为食品安全、野生动物保护和商品贸易提供有力的帮助，同时对保障广大人民群众的身体健康和生活质量，维护社会稳定和经济发展都具有积极作用。此外，DNA条形码技术在植物鉴定中也有很好的应用。总之，DNA条形码技术有利于提高涉及动植物的案件中动植物物种鉴定的检出率和准确性，揭示生物检材与案件的内在联系，为公安及相关部门执法办案提供极大的便利，也为依法打击相关违法行为提供有力的技术支持，具有广阔的应用前景。