不同施肥和栽培措施对水稻土壤微生物多样性的影响综述

吴 晶， 王娟娟， 朱腾义， 惠 珊， 刘玲玲， 钱晓晴

(扬州大学环境科学与工程学院，江苏扬州 225100)

水稻在我国粮食生产中占据着非常重要的地位。水稻高产优质栽培技术研究受到广泛关注，且取得了显著进展。水稻土壤肥力与稻米的品质和产量有着不可分割的关系，过去为了追求高产，盲目增施化肥农药，导致肥效下降，农业生产成本也不断攀升，并直接导致稻田土壤理化性质和生态环境恶化，制约了稻田土壤可持续生产能力[1]。土壤中化肥农药的施入，会使得土壤微生物的生存繁殖环境发生改变，进一步影响土壤微生物群落结构和土壤生态系统。土壤微生物分布广、数量大、种类多，在土壤系统中占据着重要地位。它们参与土壤有机质分解、腐殖质合成，是土壤养分转化和循环的动力，可维持土壤系统的稳定性及抗干扰能力，对保持土壤健康和农业可持续生产起着重要作用[2-3]。土壤生态系统的稳定与土壤微生物多样性有着密不可分的关系，一般来说，土壤微生物多样性越高越有利于土壤功能和生态系统的稳定[4]。

当前，越来越多的研究学者将水稻田地上部分植物农业性状改良的单一研究扩展到地下土壤微生物群落结构、功能的分析研究[5]，通过弄清水稻田养分供应特征及机制，掌握土壤微生物调控技术，提高土壤肥力和生产力，维护和保障稻田土壤生态功能和生态系统健康，为我国水稻高产高效栽培技术的完整性和可持续利用提供理论支持。

1 水稻生长过程土壤微生物群落结构与功能的动态特征

水稻生长过程中，土壤微生物群落结构特征是一个动态变化过程。一方面，土壤微生物通过改变植物根系生理特征和根际环境，直接影响植物获得养分的能力，例如Jetiyanon等在泰国试验研究发现，接种菌株RS87的根际促生菌能够替代水稻化肥50%的肥料施用量并能维持水稻产量[6]；另一方面，土壤微生物参与了非根际土壤的养分循环，包括养分生物固定和矿化分解、硝化和反硝化等过程[7]。氮在水稻生产中是最重要的营养元素，通过提高氮素利用率，可以减少过量氮肥施用造成的负面环境效应。作为水稻产量提升的关键驱动力，与稻田氮素循环有关的微生物过程研究一直受到相当程度的关注。

氮循环中与土壤微生物直接关联的有生物固氮、氮矿化、硝化和反硝化等过程。大气中的氮气不能直接被植物吸收，须要被合成氨后才能被植物吸收。能被植物吸收的是在土壤中被矿化成的小分子氮或氨，多种土壤微生物参与氮矿化这一过程的调控[8]。在硝化过程中，氨氧化微生物负责将氨氧化为亚硝酸盐[9]。已有研究表明，氨氧化细菌 (ammonia oxidizing bacteria，AOB) 、氨氧化古菌 (ammonia oxidizing archaea，AOA)是硝化、反硝化过程中的重要功能微生物[10]，土壤中氮素的转化与其种群结构、丰度等因素相关[11-14]。这些微生物和土壤酶参与调节土壤氮转化的生物化学过程，使得水稻在对氮素吸收利用时产生影响[15-16]。宋亚娜等利用PCR-DGGE、 DNA测序、荧光定量PCR等分子生物学技术对福建省红壤稻田不同生育期内土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌的群落结构动态变化进行探究，研究表明氨氧化细菌群落结构在生长期中的变化程度不大，在苗期-分蘖期和孕穗期-成熟期2个阶段间存在一定差异，而氨氧化古菌群落结构变化明显，不同的生育期均存在一定差异，随着水稻生长发育土壤氨氧化古菌群落多样性逐渐提高，孕穗期达到较高水平后变化平稳，且稻田土壤AOA数量比AOB更多，与土壤硝化势相关性也更高[17-18]。

2 不同施肥措施对水稻土壤微生物多样性的影响

施肥是提高作物产量的重要农业措施之一，施肥方式的不同会进一步影响土壤微生物群落结构和微生物生物量[19-20]。与此同时，土壤微生物参与养分的活化、转化和运输等过程，一定程度上改变地上植物的生产力和养分利用率[21]。特别是对水稻土而言，其特有淹水种植还原环境下，不同施肥措施对土壤微生物群落结构影响研究不够透彻[22]。

大量长期定位试验结果显示，有机肥、无机肥配施可以影响土壤的理化性质，改善土壤结构，土壤微生物数量和结构因此会发生改变[23]。裴雪霞等采用PCR-DGGE方法对黄棕壤性水稻土进行试验研究，结果表明，长期施肥能提高水稻土微生物生物量碳氮含量，并改变土壤中氨氧化细菌群落结构[24]。Xun等研究发现，将部分化肥替换成猪粪或牛粪有机肥可以改善土壤细菌群落结构，提高土壤养分的有效性，并能增加土壤微生物生物量[25]。同样，赵军等利用454焦磷酸测序法对施用猪粪有机肥的影响进行研究，得出了一致的结果[26]。

氮素营养是水稻产量和养分吸收的重要因素，植物的氮素利用一方面依靠氮摄入，另一方面如果碳源不足也会影响氮效率。水稻为了应对根外铵态氮养分水平的变化，自身调节碳氮代谢水平，这表明保持碳氮平衡是水稻氮素利用效率须要考虑的因素[27]。农作物秸秆是我国重要的农业废弃物资源，其中含有大量有机质、氮、磷、钾及中量、微量元素养分等，秸秆还田后逐渐腐解，向土壤中输入的秸秆碳促进了土壤有机质增加、微生物活性增强，改善了土壤团粒结构，提高土壤肥力[28-30]。刘骅等研究发现，长期秸秆还田能提高土壤微生物多样性及酶活性，并能有效调节土壤养分指标[31]。Doran研究表明，秸秆还田可使土壤中细菌、真菌、放线菌数量增加2～6倍，硝化和反硝化细菌数量增加更多[32-33]。Ocio等研究发现，在施加秸秆后7 d，土壤微生物生物量变为原先的2倍[34]。罗希茜等通过长期定位试验，采用了Biolog测试板分析发现，秸秆还田有利于维持微生物物种的数量及多样性，但群落均匀度会有所降低，这可能是由于长期秸秆还田促进了某些微生物种群的生长代谢[35]。韩新忠等通过大田试验研究不同小麦秸秆还田量对水稻生长、土壤微生物量及酶活性的影响，结果表明，50%秸秆还田处理增产效果最显著，由于土壤肥力的长期效应及土壤微生物生理代谢影响的复杂性，合理秸秆还田量的选择还须长期定位试验研究[36]。

绿肥是用绿色植物体制成的肥料，绿肥作物生长较快，适应性能力强，有机质含量丰富，能改善土壤团粒结构，是一种优质生物肥料[37-39]。例如，豆科的紫云英作为稻田主要绿肥作物之一，种植翻压后改善土壤物理环境，提升土壤肥力，土壤微生物活性和多样性增加[40-41]。高嵩涓基于长期双季稻-冬绿肥定位试验，应用荧光定量PCR、高通量测序等技术，研究显示，长期绿肥种植会改变硝化作用和反硝化作用的部分基因功能菌和其他功能菌属的群落功能[42]。杨曾平等在对26年冬种不同绿肥的红壤性水稻土研究时发现，长期冬种绿肥翻压处理的水稻土中微生物种群数量、微生物生物量碳氮含量、土壤酶活性有所提高，冬种效果最明显的植物是紫云英[37，43]。

3 不同栽培措施对水稻土壤微生物多样性的影响

土壤微生物多样性受多种因素影响，人类对土地和作物的管理也会使得其发生改变[44]。合理的栽培措施不仅能促进稻田生态系统的良性发展，而且可以提高作物产量和资源利用率。土壤微生物对不同栽培措施的响应较为敏感，土壤理化性质和微生物生长繁殖条件等变化均会影响土壤微生物群落结构和功能[45-46]。

作物连作后土壤环境会发生变化，土壤中有益的细菌、放线菌数量减少，土壤从细菌型向真菌型转化，导致病原微生物富集，土壤微生物多样性水平降低，加重土传病害的发生，最终表现为连作障碍[46]。而轮作措施中种植作物及残茬会增强土壤中微生物活性，增加有益微生物。在耕作过程中，对土壤投入的能源物质增多，则微生物数量会增加，对作物增产是有帮助的。张立成等通过长期定位试验对稻—稻—油菜轮作土壤与稻—稻连作土壤比较后发现，轮作土壤显著提高土壤微生物丰富度指数，据此分析稻—稻—油菜轮作栽培中这2种作物从土壤中吸收的养分不同，可以减少作物对土壤中同种元素吸收，避免出现单一养分贫乏的情况，更有利于土壤养分平衡和维持土壤微生物种群多样性[47]。

目前，我国农田耕地方式主要有传统耕作(翻耕、深松耕)、少耕(浅耕、旋耕)和免耕(留茬、留茬覆盖等)。国外的保护性耕作研究主要以覆盖休闲式免耕和少耕模式为主，由于复种指数低加上一些除草成本，这种耕作方式国内并不适用。张磊等对经过10年半旱式免耕定位试验的水稻土进行研究，结果表明实行垄作免耕法和厢作免耕的稻田土上层微生物生物量在水稻整个生育期内稳中有升[48]。陈冬林等研究在不同耕作方式下秸秆还田量对水稻土壤微生物的影响，结果表明土壤耕作有利于晚稻生育前期与后期土壤微生物活性的提高，耕翻使土壤中真菌、嫌气性细菌数量减少[49]。秸秆深耕还田技术是将深耕和秸秆还田方式相结合，通过这种技术，使得土壤层频繁扰动，通气性增加，微生物与秸秆等有机质接触面积增大，营养源的丰富促进了微生物生长，提高了土壤酶活性[50]。赵亚丽等研究发现，与常规耕作相比，深耕+秸秆还田处理土壤微生物数量、土壤酶活性分别提高了45.9%、34.1%[51]。

4 水稻土壤微生物多样性的主要研究方法

传统的微生物培养法是将土壤中可培养微生物采用不同营养成分的培养基进行分离培养，但有些微生物实验室条件下不可被培养，扩大了生长繁殖快的微生物数量[52-54]。另一种Biolog微平板法是通过测定土壤微生物对不同单一碳源的利用与代谢能力差异，用于评价土壤微生物群落多样性。蔚霞运用Biolog ECO微平板对转Bt基因水稻在淹水条件秸秆还田后对土壤微生物功能多样性的影响进行研究，其研究结果[55]与前人结果[56-57]存在部分差异，这可能与培养环境、水稻品种、选择的微平板类型等因素相关，故建议其他方法与Biolog微平板法结合使用，以便得到更全面的结果[58]。

2005年以来，高通量测序技术飞跃式发展，已经成为主流的分子生态学研究手段，可识别微生物资源和功能的程度由1%提高到30%左右，这为揭示养分循环的土壤生物功能和区域分异规律提供了契机[21]。微生物多样性测序(别称扩增自测序)是利用2/3代测序平台，对16S rDNA/18S rDNA/ITS/功能基因等特定区段PCR产物进行高通量测序，突破传统微生物不可培养的缺点，获得环境样本中微生物群落结构、进化关系以及微生物与环境相关性等信息。稳定性同位素核酸探针(DNA/RNA-based Stable Isotope probing，DNA/RNA-SIP)技术通过稳定性同位素示踪微生物DNA/RNA，能在分子水平上研究关键元素的微生物调控机制[59]。郑燕等利用稳定性同位素核酸探针技术对6种典型水稻土中的微生物甲烷氧化过程进行研究，有效地克服将复杂土壤环境中甲烷氧化过程及其微生物作用直接偶联的技术难点[60]。郭赟利用稳定性同位素示踪技术结合454高通量测序，研究了长期施肥对活跃的AOA和AOB的影响[61]。

为了验证后期结果(或目标基因)，荧光定量PCR技术是用于验证测序结果是否可靠的常规方法之一。实时荧光定量PCR(qPCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号实时监控，最后未知的模板根据标准曲线进行定量分析的方法[62]。贾仲君等对典型水稻土微生物组的细胞数量进行研究，结果表明，传统显微计数结果显著低于qPCR技术，最高可达3个数量级[63]。刘琼等选取4种典型稻田土壤进行室内培养试验，选择用qPCR、克隆测序以及末端限制性长度多态性分析(T-RFLP)技术对参与卡尔文循环基因cbbL和cbbM的丰度和群落结构进行研究[64]。不论是传统显微技术方法还是现代分子生物学方法，应该根据对象需求和各项技术优势，合理选择研究技术方法，为土壤微生物演化规律和环境功能提供技术支撑。

5 展望

调控土壤微生物为主的管理措施将是未来研究高产高效农业的发展趋势，水稻作为我国主要的粮食作物，其发展若仅仅以“高产”为目的，其生产措施将不可持续。随着人们对土壤微生物认知的加深，更加重视和农学领域的融合，未来会有良好的发展前景。目前对水稻土壤微生物的研究还有许多问题尚未解决。因此，建议进一步加强以下几个方面的研究：

(1)很多关于水稻土壤微生物的研究往往针对生长期中某一时期的土壤，对水稻整个生育期土壤微生物群落结构进行比较综合分析的研究较少。水稻的生长发育是在一个与土壤、微生物相互作用的环境系统下进行的，水稻发育势必影响稻田土壤微生物群落结构，反之亦然。因此，对水稻生长期土壤微生物群落结构与功能的动态特征研究很有必要，这为探究土壤中某些微生物基因及功能研究奠定理论基础。

(2)微生物介导的水稻-土壤之间的养分循环和养分高效利用之间的机制，目前尚未研究透彻，有些对稻田土壤微生物的研究停留在对现象的描述，有待进一步探究。

(3)在分析水稻土壤微生物群落结构时，单一的方法可能会导致对试验结果的片面解释，因此应该采用多种技术相结合的方法。新一代454高通量测序、环境基因组学与SIP技术的结合与综合应用将成为热点。

(4)水稻土的取样对土壤微生物群落结构的影响很大，很多时候会对土壤湿度、土壤温度以及可利用残留物和作物的季节变化等因素有所忽略，因而对水稻土微生物取样标准的统一是须要关注的。

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