条件重编程细胞在肿瘤治疗中的研究进展

据国家癌症中心数据统计，中国恶性肿瘤发病率为380.4万/年，癌症已成为中国乃至全球主要的死亡原因，给社会带来了沉重的经济负担。癌症是一种高度异质性的疾病。近年来高通量测序技术不仅阐明了多种癌症的突变过程，而且提供了一个全面的癌症基因目录［1］，目前基因组分析和靶向治疗已经应用到几乎所有类型的肿瘤治疗，但随之出现肿瘤耐药性、耐药的原因以及新型肿瘤药物的研发已经成为临床重点关注的问题。迄今为止，传统建立的肿瘤细胞系一直是细胞、分子和癌症生物学的支柱，然而肿瘤细胞系经长期体外培养后，其生物学行为及基因谱表达水平、肿瘤异质性都与原始肿瘤组织存在较大的差异，不能准确地反映原始肿瘤异质性和肿瘤细胞微环境等特点，因此不适用于筛选临床新型化疗药物，以及对肿瘤患者进行个体化治疗。

Liu等［2］提出条件重编程细胞（conditional repro⁃grammed cells，CRCs）可在实验室中无限制培养出正常的细胞和肿瘤细胞。CRCs的培养方法较多，不同组织来源的细胞培养方法不同，本文主要研究CRC在Rho激酶抑制剂（Y−27632）存在的情况下，将经辐射过的小鼠成纤维细胞Swiss 3T3 J2作为饲养细胞与正常和肿瘤的人上皮细胞共培养的技术。该技术高度保留肿瘤细胞的基因型和表现型、瘤细胞的特征，有助于肿瘤模型的构建。本文就CRCs在肿瘤治疗中的研究进展及应用前景进行综述。

1 CRCs与其他细胞培养方法比较

众所周知，体内的细胞在自然状态下很难在体外保持长期增殖活力。目前有几种实现永生化的方法。最常见的方法是利用病毒致癌基因来改造宿主细胞的基因组，如SV40的大型T抗原32以及乳头瘤病的E6/E7蛋白；或者在基因组植入人类的端粒酶反转录酶（hTERT）33和cdk4，然而这些遗传操作导致基因组不稳定，使得体外传代若干次后，关键生物学和遗传特质发生不可逆的损失［2］。大多数原代细胞，无论培养方式有何差异，都难以维持体外增殖，最终迈向衰亡［3］。iPSC或ES均可在体外繁殖并保留正常核型，在再生医学中显示出巨大的潜力［4］，然而，如何精确的将其分化成特定的组织目前尚难以做到，某种程度上，使用人体ES细胞违背伦理学的要求，且iPSC需要转入可以改变细胞生长和分化特性的外源性基因［5］，另外，这些方法的效率相对较低。近年来，人源性肿瘤移植瘤模型（patient−derived xenograft，PDX）逐渐成为药物研发过程中临床前药物的首选筛选工具［6］。PDX模型能够保留原始肿瘤组织绝大部分生物学特性及重要的遗传信息，较高程度地反映原始肿瘤复杂的异质性与分子多样性，在某些情况下已被证明可以预测治疗反应。然而，由于其成瘤率低且不稳定、建模时间长、不能用于筛选免疫相关类药物、价格昂贵、很难建立高通量平台等诸多不足，仍需要大量科学研究进行解决。

类器官［7］能准确模拟体内上皮结构并能够表现出细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，具有稳定的表型和遗传学特征，可作为筛选药物的新途径，开辟了基因和干细胞治疗疾病的新途径。尽管类器官的前景广阔，但需要大量起始细胞，不适于高通量筛选，而且经常呈现出较低的体外活力以及缺乏血管。

相比上述方法，CRCs能够维持肿瘤组织和正常组织体外无限期增殖，研究表明其能保持组织核型及遗传物质不受改变，即CR细胞和患者肿瘤组织在病理学、基因组学保持一致，并且保留肿瘤细胞完全分化的能力。CR细胞可用于诊断和预测医学、再生医学、药物敏感性测试、基因表达谱分析和异种移植研究等方面。

2 CRCs的培养条件

2.1 CRCs的“饲养者”—辐射后的Swiss−3T3 J2小鼠纤维原细胞

CRCs是一种在Rho激酶抑制剂（Y−27632）存在的情况下，将辐射过小鼠成纤维细胞Swiss 3T3 J2作为饲养细胞、与正常和肿瘤的上皮细胞共培养技术。在培养基中加入Swiss 3T3 J2充当组织细胞“饲养者”。使用辐射过的小鼠成纤维细胞培养的上皮细胞几乎以恒定的速率生长，辐射是实现永生化的重要因素，并且是刺激饲养细胞产生和/或释放生长因子的必须因素。其次，饲养细胞在培养基中释放生长因子，诱导端粒酶逆转录酶（hTERT）活性，从而促进细胞的无限期增殖。hTERT是细胞永生化的关键因素。Palechor−Ceron等［8］证明在含有饲养细胞的培养基中，存在或缺少Y−27632，hTERT的表达显著高于不含饲养细胞的培养基，而且Y−27632在不存在饲养细胞的情况下不会永生化。饲养细胞释放的生长因子是如何实现诱导hTERT的表达目前仍是未知。饲养细胞促进条件重编程永生化并不需要直接的物理接触，即饲养细胞释放的生长因子与Y−27632相配合，从而促进上皮细胞的增殖和存活。

2.2 ROCK（Rho激酶）抑制剂Y−27632

Watanabe等［9］发现Y−27632能增加人胚胎干细胞的克隆效率与角质细胞干细胞的活力。Chapman等［10］提出与饲养细胞共培养时，Y−27632诱导细胞可无限期增殖。该研究表明，饲养细胞与Y−27632诱导细胞无限增殖的能力与HPV−16 E6和E7致癌基因相似。E6和饲养细胞均可以激活端粒酶活性［11］，E7和Y−27632均破坏了肌动蛋白/肌球蛋白骨架［12］，并且可以使Rho激酶失活；表明Y−27632可能干扰P16/Rb途径，从而调节细胞增殖。Suprynowicz等［13］发现Y−27632可以明显增强上皮干细胞标记物ΔNp63α和CD−44的表达，同时减少Notch−1表达，与饲养细胞结合后，Y−27632又可以增加α6和β1整合素以及β−连环蛋白的表达，且这种干性表达是广泛表达；Y−27632可以增强角质形成细胞的增殖并抑制其分化［11］；缺乏Y−27632和饲养细胞时，人包皮角质形成细胞（HFKS）的增殖明显减少，相反Y−27632明显刺激细胞的增殖，与Y−27632和饲养细胞存在的情况下增殖情况相似，表明Y−27632可直接作用于HFKs，其主要通过抑制钙和血清诱导的分化来促进增殖，这种增殖只是暂时的，在不存在饲养细胞的情况下，不能实现HFKS的无限增殖；进一步研究又发现，Y−27632不能增强饲养细胞的生长因子的释放。

总之，目前CRCs促进细胞永生化的机制尚研究中。饲养细胞与Y−27632在F培养基中诱导细胞无限增殖的两个主要功能主要通过：1）诱导端粒酶逆转录酶活性；2）细胞骨架重塑和/或干扰P16/Rb途径。

3 CRCs的临床应用

CRCs允许从各种组织类型建立患者衍生的正常和肿瘤上皮细胞，培养无法在体外增殖但又具有重要生理功能的细胞，如肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡ，ATⅡ）等，有助于深入探讨其生理功能及相关病理过程。CRCs具有分化成起源组织的能力，当前列腺组织重编程细胞注射到免疫缺陷小鼠的肾小囊下时，可分化成良好的前列腺上皮。气管支气管组织CRCs在体外可分化成纤毛细胞和黏膜细胞。

利用CRCs不仅可以发现新的疾病治疗方法，而且可以用于新药研发。对于临床上产生严重耐药的恶性肿瘤患者，可以对其肿瘤CRCs进行基因突变检测及药物敏感性选择，由此制定符合患者实际病情的个体化给药方案。如Yuan等［14］利用CRCs建立了侵袭性复发性呼吸道乳头状瘤患者的正常和肿瘤肺组织细胞培养物。该研究应用基因组学分析发现喉癌肿瘤细胞含有野生型7.9−kb人乳头状瘤病毒11型基因组，肺肿瘤细胞含有10.4−kb基因组。进一步利用药物敏感性测试，确定伏立诺他胺作为特异性潜在的治疗剂，临床治3个月后，病灶开始缩小。Timofeeva等［15］利用培养出的前列腺正常细胞和肿瘤细胞，证明基底细胞群作为前列腺肿瘤的主要来源，同时说明CRCs在饲养细胞和Y−27632存在的条件下可维持高水平的增殖和低水平的分化，一旦置于体内或模拟其自然环境的条件下可完全分化。研究者研究多西他赛对CRCs的敏感性，匹配的正常细胞和肿瘤细胞的IC50值分别是1.79µm和0.29µm，这些数据可以说明匹配的正常和肿瘤细胞可用于患者的个体化治疗或者用于发现新型药物。Ringer等［16］发现新型CDK抑制剂VMY能诱导前列腺肿瘤细胞系产生p53依赖性自噬，进而促使细胞凋亡，结果亦在人前列腺癌CRCs上得到证实。在移植方面，通过获得患者自身少量的细胞，使培养的CRCs按相应器官的3D模型增殖，由此产生再生器官［11］。黎张燕等［17］利用CRCs技术建立肺癌体外培养体系，采用MTS方法检测6例肺腺癌细胞对临床常规化疗药物顺铂、卡铂、奈达铂、长春瑞滨的敏感程度，结果显示患者肺腺癌细胞整体对铂类药物敏感率高，而对长春瑞滨的敏感率低，与临床情况具有一致性，也与之前的研究结果相似。目前，CRCs已被用于筛选新药或发现新靶点［18］、靶向治疗耐药性肺癌的研究［19］和其他类型的上皮细胞研究［20−22］。CRCs可同时对肿瘤组织细胞和正常组织细胞进行无限增殖，是生物医学界的重大发现，不仅可用来研究疾病机理及药物敏感性测试，而且可实现体外培养复杂的器官，或将成为新的药物发现平台，从而实现真正的精准医疗。

4 CRCs优越性及缺陷

尽管CRCs操作过程简单，短时间内即可实现细胞无限增殖，而且保留细胞本身的基因型、表现型、永生化和分化的能力，具有可控性，但仍面临较多问题。首先该方法实现细胞永生化和保留分化能力的机制仍不明确，还需要进一步的研究。其次辐射后的饲养细胞抑制了肿瘤相关基底细胞的过度生长，但是难以测定基底细胞对肿瘤细胞生长的影响及其对肿瘤药物的治疗影响。在大量的实验过程中，由于穿刺组织或手术组织中含有成纤维细胞，在培养物中经常发现混杂着成纤维细胞，从而影响肿瘤细胞的生长。而且肿瘤组织标本经常混杂正常组织，在培养物中难以区别出正常的上皮细胞，从而进一步影响研究结果。最后，因为Y−27632可以改变肌动蛋白骨架，从而可能干扰肿瘤细胞迁移和侵袭的能力。

5 结语

综上所述，条件重编程技术尽管机制尚不清楚、培养物不能完全纯化、部分组织存在成纤维细胞、Y−27632影响肿瘤迁移和侵袭的测定等缺陷，但是这项活组织培养新技术能够保留肿瘤细胞和正常细胞的基因型和表现型，实现细胞的无限期增殖，并且保持完全分化的能力，为肿瘤化疗耐药的患者提供可靠的细胞及体内模型用于研究耐药机制和筛选新型药物，进一步实现肺癌患者的精准医疗，同时有望为建立活生物库、实现再生医学以及开展新的癌症研究提供基础。