应用GAL4/UAS异位表达系统筛选果蝇视觉基因的研究

杨治平， 陈晓姣， 李建波， 郭抗萧， 严永旺， 杨智英

(1中南大学湘雅三医院产科， 长沙 410013； 2长沙卫生职业学院生物化学教研室， 长沙 410100；3中南大学基础医学院组织胚胎学系, 长沙 410013)

视觉接受外界80%的信息，是人和动物的主要感觉。从上世纪60年代开始科学家就将果蝇视觉系统作为研究模型进行遗传学分析。生物学研究表明果蝇视觉系统的发育与脊椎动物具有共同的进化起源[1]。果蝇和哺乳动物的视觉神经回路非常相似，两者都具有结构和作用模式相似的光感受器。果蝇视觉系统具有精密的功能，且实验操作方便，果蝇结构的特殊性和作用途径的保守性使其成为人们研究视神经发育、突触可塑性、轴突导向和神经环路的优秀模型。果蝇的眼睛是由750～800个结构相同重复排列的六边形“小/单眼”组成的复眼结构，每个小眼中有20个细胞，其中有8个是视网膜感受器细胞(感光细胞,receptor cell)。果蝇的视觉系统具有精确的结构及分层，果蝇成虫的视觉系统包括视网膜(复眼)和4个视神经节，分别为：薄板、髓质、小叶、小叶板[2]。视网膜区是以小眼为基本单位构成，每个小眼的感光细胞表达不同的rhodopsin基因，果蝇编码7种不同的rhodopsin基因，他们分布在不同的感光细胞中感知不同的光刺激。果蝇生命周期短，易于在实验室培养，成为最常用的人类疾病动物模型。2000年果蝇全基因组序列测定完成，其基因高度保守，在确认的287个人类疾病基因中，可以比对出197果蝇同源基因，很多果蝇基因被证明是人类同源基因或肿瘤抑制基因的同源基因[3-4]。本研究利用GAL4/UAS系统结合视网膜电位(electroretinogram, ERG)快速筛选果蝇视觉系统功能基因。通过对随机插入UAS系列的46株果蝇品系进行视觉基因筛选，分离得到ERG图谱异常的突变体，可用于人类视觉功能基因的初筛，为鉴定和研究人类视觉基因的功能提供参考。

1 材料与方法

1.1果蝇品系GAL4品系ninaE-Gal4/GMR(Ⅱ)(光感受器表达)、Elva-Gal4(神经细胞表达)均购自美国 Bloomington果蝇中心；实验中使用的UAS果蝇品系及W1118均由美国麻省大学医学院神经生物学系Li实验室提供。本研究所有果蝇均在22℃～25℃环境下培养，培养基为标准的玉米粉-糖蜜-酵母培养基。

1.2方法

1.2.1 果蝇杂交

1.2.1.1 构建ninaE-Gal4/+;W1118/+果蝇 将ninaE-Gal4雄性果蝇与W1118处女蝇杂交，收取其F1代，得到ninaE-Gal4/+;W1118/+目的果蝇，后者为本研究正常对照果蝇。

1.2.1.2 构建ninaE-Gal4/UAS候选基因RNAi果蝇 将携带UAS因子的46株果蝇(挑选处女蝇)与ninaE-Gal4雄性果蝇分别进行杂交，收取其F1代，得到ninaE-Gal4/UAS系列的RNAi果蝇。

1.2.1.3 构建Elva-Gal4/UAS候选基因RNAi果蝇 将携带UAS因子的46株果蝇(挑选处女蝇)与Elva-Gal4雄性果蝇分别进行杂交，收取其F1代，得到Elva-Gal4/UAS系列的RNAi果蝇。

1.2.2 数据采集 用JSM-6360扫描电子显微镜观察目的果蝇成虫复眼外形结构。记录ERG：用胶带将需要检测果蝇轻轻地粘在塑料板上，身体倾斜45°左右，小心将导电溶液均匀投抹于果蝇眼睛和背部，参比电极放置于果蝇背部，同时记录电极放置于果蝇眼睛表面，通过给光、去光刺激视网膜，细胞内电位计检测视网膜电位，记录所得实验结果并进行分析，分析果蝇眼睛对光刺激的光感受变化。

2 结果

2.1获得ninaE-Gal4/UAS和Elva-Gal4/UAS系统的RNAi果蝇观察获取的系列RNAi果蝇复眼外形，正常对照组果蝇复眼结构完整，纹路清晰(图1a)。大部分RNAi果蝇复眼外形正常，但少部分RNAi果蝇复眼外形出现异常，其中Gal4/UAS RTF1 RNAi果蝇、Gal4/UAS Sas-4 RNAi果蝇单眼结构清楚，但部分区域刚毛稀少、刚毛短且有折断(图1b、c)；Gal4/UAS So RNAi果蝇部分区域结构异常隆起，刚毛稀少，刚毛短且有折断(图1d)；Gal4/UAS DLG RNAi果蝇 、Gal4/UAS CG14591 RNAi果蝇复眼完全塌陷、眼睛结构完全破坏，结构不完整，单眼不清楚，刚毛非常稀少且有折断(图1e、f)。

2.2RNAi果蝇ERG检测大部分RNAi果蝇ERG检测正常，共筛选出5类异常ERG图谱。正常对照组果蝇ERG显示在给光、去光刺激时视网膜电位呈现明显改变，且振幅一致(图2a)；Gal4/UAS DLG RNAi 果蝇ERG显示给光、去光刺激视网膜电位无改变，对光刺激显示没有反应(图2b)；Gal4/UAS RTF1 RNAi 果蝇ERG显示去光刺激视网膜电位改变不明显(图2c)；Gal4/UAS Sas-4 RNAi果蝇 ERG显示去光刺激视网膜电位改变不明显，振幅降低(图2d)；Gal4/UAS CG14591 RNAi 果蝇ERG结果显示给光、去光刺激视网膜电位改变非常不明显，振幅明显降低(图2e)；Gal4/UAS So RNAi 果蝇ERG结果显示给光刺激时视网膜电位改变不明显，振幅降低(图2f)。这些异常ERG结果显示视网膜对给光、去光刺激反应出现明显异常，眼睛功能受到一定程度影响。

2.3筛选结果对GAL4/UAS系统杂交产生的ninaE-Gal4/UAS RNAi果蝇和Elva-Gal4/UAS RNAi果蝇进行ERG检测，得到相应的视网膜电位图，根据视网膜电位检测结果并结合复眼表面结构筛选出果蝇视觉系统功能基因5种，见表1。

a: 对照果蝇眼正常(×200)

b、c: 果蝇复眼结构正常，刚毛稀疏

d: 果蝇复眼局部隆起，刚毛稀疏

e、f: 果蝇视网膜变性，复眼完全塌陷、眼睛结构完全破坏，感受器结构不完整

图1果蝇复眼外形

a: 对照组反应正常，视网膜电位明显改变，振幅一致

b: 不正常，给光、去光刺激视网膜电位无改变，对光刺激显示没有反应

c: 不正常，去光刺激视网膜电位改变

d: 不正常，去光刺激视网膜电位改变不明显，振幅降低

e: 不正常，给光、去光刺激视网膜电位改变非常不明显，振幅明显降低

f: 不正常，给光刺激时视网膜电位改变不明显，振幅降低

图2果蝇ERG检测

3 讨论

GAL4/UAS二元表达系统广泛应用于黑腹果蝇、小鼠和植物的基因功能研究，且遗传操作实验效率高、重复性好。GAL4系统受特定组织特异性增强子或/和启动子驱动，表现出特异的时空表达模式，此外该系统还能用于在体过表达或基因沉默。UAS是GAL4的结合区域，当与GAL4结合的时候可以驱动UAS下游基因的表达，启动该基因转录和翻译；而在结合位置空白的时候，则使UAS下游基因保持沉默[5]。GAL4驱动者品系和UAS目的基因品系独立存在，二者可以多种组合方式，可以通过杂交在特定组织表达或沉默不同的基因，也可以在不同组织表达或沉默同一基因，这极大地丰富了研究的范围，为探讨基因和蛋白功能提供了多种途径[6]。本文分别构建了46株ninaE-Gal4/UAS(光感受器)和Elva-Gal4/UAS(神经细胞)基因RNAi果蝇，获取因功能丧失(loss of function)后引起一系列表型改变的果蝇，从而从46种基因中找到与视觉功能直接相关的基因。

表1 异位表达时引起ERG异常的UAS品系

在检测的GAL4/UAS RNAi品系果蝇中，本研究共发现有5种RNAi品系果蝇复眼外形结构和ERG图谱异常(ninaE-Gal4/UAS和Elva-Gal4/UAS品系均出现异常)。研究结果表明果蝇相关功能基因功能丧失引起异常表型，需要进一步研究这些相关基因的功能。目前，也有文献报道利用GAL4/UAS系统进行基因功能研究。Vinatier等[7]利用GAL4系，将引起人类脊髓小脑共济失调的多聚谷氨酰胺在果蝇复眼中表达，观察到和人类病理特征相同的核包涵体的出现以及细胞退化，证实人类和无脊椎动物之间多聚谷氨酰胺重复致病机理的一致性。Atkins等[8]利用GAL4系在翅膀和触觉器等处将ey基因异位表达，发现正常发育的眼在异位形成，该眼含有整套感光细胞和分化完全的小眼，这证实ey是调控黑腹果蝇复眼发育的主要基因。Tabuchi等[9]运用WGA与肌肉特异性GAL4驱动器组合在果蝇中追踪突触神经通路的应用，他们认为GAL4/UAS-WGA系统在研究解剖果蝇神经回路的形成和突触发育阶段功能基因的研究中起重要作用。Sandrelli等[10]利用GAL4/UAS-nonA表达并结合ERG分析该基因在正常视力、求偶歌曲中的作用。

GAL4/UAS二元表达方法也有缺陷，可能发现在所感兴趣的组织非正常表达的基因，只有对筛选的基因进一步详细分析后才能确认筛选出的果蝇视觉基因是否成功。在果蝇视网膜神经细胞和光感受器筛选出的5种视觉相关基因，还需要检测它们的基因敲除突变体，进一步分析研究这些基因将会增加我们对视觉图谱发育的了解。同时，还需要摒弃GAL4/UAS系统可能造成的假阳性和假阴性结果，如GAL4蛋白的表达量不足以激活UAS目的基因，就会导致后者出现表达滞后现象；如GAL4蛋白不能得到及时清除降解，就会导致激活时间延长，这些都会影响基因功能分析和时间效应评价。本研究获得ninaE-Gal4/UAS和Elva-Gal4/UAS 2种品系，进一步对筛选结果进行比较，获得引起果蝇眼睛表型异常的有DLG、RTF1、Sas-4、So、CG14591。果蝇的眼睛与人类不同，但最基本的结构和功能有许多相似之处。青光眼是导致完全失明的第二大病因，其由于视网膜变性所导致的完全失明不可逆转，目前尚无有效疗法。从长远来看，视网膜再生能给他们恢复视力、重见光明带来希望。对光感受器功能基因的筛选和研究，可能有助于研究视网膜再生，为视网膜变性失明患者带来希望[11-12]。本研究通过筛选虽然获得引起视觉异常的分子，但是这些基因的功能及作用机制仍然不清楚，需要进一步鉴定这些基因并确定这些基因在视觉系统中的角色。这些研究结果可用于人类视觉功能基因的初筛，为研究这些基因的功能积累资源并为临床应用提供有意义的参考。

[1] FRIEDRICH M. Drosophila as a developmental paradigm of regressive brain evolution: proof of principle in the visual system[J]. Brain Behav Evol, 2011, 78(3):199-215.

[2] MONTELL C. Drosophila visual transduction[J]. Trends Neurosci,2012, 35(6):356-363.

[3] WYLIE A, JONES A E, ABRAMS J M. p53 in the game of transposons[J]. Bioessays, 2016, 38(11):1111-1116.

[4] MOLLEREAU B, MA D. The p53 control of apoptosis and proliferation: lessons from Drosophila[J]. Apoptosis, 2014, 19(10):1421-1429.

[5] HALDER G, CALLAERTS P, GEHRING W J. Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila [J]. Science, 1995, 267(5205):1788-1792.

[6] WARRICK J M, PAULSON H L, GRAY-BOARD G L, et al. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila[J]. Cell,1998, 93(6):939-949.

[7] VINATIER G, CORSI J M, MIGNOTTE B, et al. Quantification of Ataxin-3 and Ataxin-7 aggregates formed in vivo in Drosophila reveals a threshold of aggregated polyglutamine proteins associated with cellular toxicity[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 464(4):1060-1065.

[8] ATKINS M, JIANG Y, SANSORES-GARCIA L, et al. Dynamic rewiring of the Drosophila retinal determination network switches its function from selector to differentiation[J]. PLoS Genet, 2013, 9(8):e1003731.

[9] TABUCHI K, SAWAMOTO K, SUZUKI E, et al. GAL4/UAS-WGA system as a powerful tool for tracing Drosophila transsynaptic neural pathways[J]. J Neurosci Res,2000, 59(1):94-09.

[10] SANDRELLI F, CAMPESAN S, ROSSETTO M, et al. Molecular dissection of the 5′ region of no-on-transient A of drosophila melanogaster reveals cis-regulation by adjacent dGpi1 sequences[J]. Genetics,2001, 157(2):765-775.

[11] WITTKORN E, SARKAR A, GARCIA K, et al. The Hippo pathway effector Yki downregulates Wg signaling to promote retinal differentiation in the Drosophila eye[J]. Development, 2015, 142(11): 2002-2013.

[12] BERNARDO-GARCIA F J, FRITSCH C, SPRECHER S G. The transcription factor Glass links eye field specification with photoreceptor differentiation in Drosophila[J]. Development, 2016, 143(8):1413-1423.