有性杂交结合胚挽救在无核葡萄育种上的应用

梁树乐，李林，刘少杰，迟晓红，阎立江

（中国农业大学烟台研究院，山东烟台264670）

目前无核葡萄深受消费者喜爱，可以鲜食，也可加工成葡萄干，大粒、无核是国内外葡萄育种的重要目标。由于无核品种的合子胚在发育进程中容易发生败育，传统的无核葡萄育种方法，只能以有核品种做母本，无核品种作父本，获得有发芽力的杂交种子，但这种杂交方式，无核后代较少，育种效率很低。为防止育种效率的降低，通过对植物胚离体培养进行胚挽救，使得植物胚在适宜的离体培养条件下获得再生植株。利用胚培养技术，可以用无核葡萄作母本进行杂交，获得的合子胚在其败育前进行人工离体培养，促使胚萌发成苗，不仅获得的胚挽救苗无核性状比率高（45%～82%），而且试验去除了中间母本和第二代回交，比常规培育无核葡萄品种的方法节省了至少5年时间，极大地推动了无核葡萄育种的进程，在植物育种中具有十分重要的意义[1]。

我国自20世纪80年代末开展无核葡萄胚培养的研究，亓桂梅[2]、王劲松[3]、刘小宁[4]、郝燕[5]、蒋爱丽[6]、张剑霞[7]等先后对无核葡萄的胚培养技术和应用做了大量研究，也培育出部分无核胚培养的新种质。因此通过多组合杂交，胚培养结合分子辅助育种，培育大粒无核葡萄新品种，不仅可以改善葡萄种植品种单一的局面，而且大粒、无核、优质葡萄品种的大面积推广应用，所产生的生态效益、社会效益和经济效益极其显著，生产前景广阔。

1 杂交技术

1.1 杂交亲本的选择与选配

由于葡萄无核性状遗传的机制复杂，无核葡萄的育种难度很大，目前利用种子败育型无核葡萄作母本，与无核白、奥兰多无核、莱克蒙特等杂交以后易形成合子胚；以抗病性强的优质、大粒欧美种及欧亚种作父本，一般来讲，不同的父本对胚的发育影响也不同，在田间进行有性杂交，在受精胚败育前采集田间幼果，无菌条件下进行离体胚培养、以获得杂种后代植株。

1.2 杂交前的准备

根据育种目标，确定杂交组合的数量。组合数和杂交花序的多少取决于育种目标的综合程度及性状的遗传性质。葡萄种间杂交时，如果亲本间花期相差过大，可以采用人工花期调整，将花期晚的用塑料棚覆盖升温，可以提高花期10 d以上，也可使用化学试剂提前打破葡萄休眠，使不同亲本的花期一致。

1.3 杂交授粉

在父本开花前的1d，采下发育正常的整个花序，除去顶部，带回室内，摘下花蕾，平铺于光滑的纸上，在室内阴干，收集的花粉装于小玻璃瓶中，用棉花塞紧瓶口，挂上标签，备用。因葡萄的花器小，且普遍存在“闭花受精”现象，一般最佳的去雄日期是开花前3～4 d，去雄先从花序的基部开始，去雄过程中适当疏除部分过小和发育不完全的花或花序，然后套上硫酸纸袋；去雄后的2～3 d，当部分花的柱头上出现水滴状粘液时是授粉的最佳时期，可利用橡皮蘸柱头进行授粉，重新套上纸袋。

2 胚挽救技术

2.1 胚挽救技术操作

进行胚挽救的时间选择很重要，一般受精时间短，胚珠小，在无菌台操作相对困难，所以胚在胚珠发育的时间越长越好，但是无核葡萄育种的杂种胚，发育到一定时期会很快败育，所以要在胚败育前取出来进行人工培养，通常在授粉后30～55 d左右，取杂交幼果的胚珠进行培养，一般每隔5 d取一次幼果，首先用自来水冲洗果穗数次，然后用毛笔或软刷蘸洗衣粉充分洗刷每个果粒，用自来水冲洗2 h，置于超净工作台上用75%的酒精处理30 s，用无菌水冲洗3次，再将果穗放入0.1%的升汞消毒液中浸泡7～8 min，用无菌水漂洗3～5次。将消毒后的葡萄果粒放在无菌载玻片上，用解剖刀切开，取出胚珠，每个三角瓶中放5～10枚，在Nitsch胚发育培养基培养60 d左右，然后在显微镜下剥取胚接种到胚萌发和成苗培养基中，一般选用1/2MS培养基的较多，在胚挽救过程中，注意随着胚的发育成长及时更换培养基。

2.2 胚挽救的影响因素

2.2.1 外源激素

外源激素在胚挽救中起决定性作用。不同种类、不同浓度的激素，不同的葡萄品种，激素的作用差异很大[8-12]，在胚珠内胚初期培养阶段，所需的激素简单，一般不需在培养基中加外源激素，激素浓度如果较高，会引起幼胚形成愈伤组织，导致胚培养失败[13]。胚经胚珠内培养后剥离出来再培养，是提高无核葡萄胚萌发率的一项重要措施。通常采用先胚珠内培养，再剥取裸胚培养的措施，来提高无核葡萄胚挽救的成功率。

2.2.2 组培环境

无核葡萄胚挽救受组培环境的影响较大，如温度、光照、pH值等。胚发育阶段应给予充足的光照，胚萌发成苗阶段初期则给予弱光，以利于胚芽生长发育，而后期则进行强光培养以提高成苗质量。培养室内一般保持恒温25℃下进行培养，以满足胚的生长需求。

2.3 胚挽救苗的移栽管理

试管苗的移栽是否成功是整个育种环节的关键。在胚挽救苗移出瓶之前，培育壮苗。选择皮层生根5～6条，根长4 cm以上，有4～5片叶子的，苗高5 cm以上，叶色浓绿，无污染的壮苗，在生根30 d以后进行移栽，将胚培养瓶苗拿到带有遮阴网的大棚中进行炼苗，前2 d不打开盖子，2 d后将瓶盖拧松，让组培苗逐步适应外界的环境条件，3 d后，用镊子从试管中取出发根的小苗洗掉根部粘着的培养基，冲洗干净，用800倍的多菌灵浸泡试管苗1～2 min，然后将小苗移入50孔的穴盘中，栽培基质为进口草炭土:珍珠岩（2:1），栽后用喷壶轻浇水。一周内维持环境温度在25℃左右，栽植后定期对幼苗喷洒杀菌剂，如多菌灵、甲基托布津等，每7 d喷一次。在移栽前，必须进行光照和温度的锻炼，避免日烧。移入田间株行距保持0.3 m×0.8 m，前2周注意遮阴，保持土壤湿润，使幼苗逐渐过渡到田间环境。随着小苗的生长，一个月后进行常规的肥水管理，后期注重多施磷钾肥，使葡萄枝条充实。秋季落叶以后，将苗木起出进行假植覆土，利于苗木安全越冬。

2.4 大田栽植及胚挽救苗的结果观察

准备用来栽植胚挽救杂交苗的大田，进行深翻改土，充分施入腐熟好的有机肥，苗木按照0.5 m×2 m的株行距进行定植，做好标记，注重常规的田间管理。一般杂交苗2～3年就可结果，对于优良的单株，可以采取种条进行苗木繁育，分区域进行选择鉴定，测试比较不同生长条件、生态条件下不同株系高产性状、果实性状的表达，筛选出优质大粒无核的葡萄株系。