MiRNA对成骨分化调控及骨质疏松发生的研究进展

潘虹旭

上海市嘉定区中心医院口腔科，上海 201800

微小RNA(micro RNA, miRNA)是一类长度为16～29nt的茎环状内源性小RNA， 其存在于所有真核细胞中，miRNA基因大多位于非编码区内，少量位于编码区内。miRNA的表达具有组织特异性和发育阶段特异性，其参与调控人类近1 / 3的蛋白编码基因并在细胞增殖、分化、凋亡以及个体生长发育过程中发挥着重要的作用[1]。miRNA对靶基因进行转录后调控，其通过与靶mRNA特异性结合从而诱导其降解或翻译抑制，当某些miRNA含量发生异常变化，其调节的靶基因表达水平也将随之改变，进而诱发相应症状[2,3]。

骨组织中时刻发生着成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞参与的骨吸收，两者之间维持着动态平衡的状态，活跃的骨代谢水平使骨骼不断更新，维持骨组织健康。miRNA可通过调控间充质组织的成骨分化和破骨细胞的分化成熟调节骨组织代谢水平，因此骨代谢相关miRNA的异常表达与骨质疏松等骨代谢相关疾病的发生必然具有密切的联系[4-6]。

1 miRNA的调节成骨分化作用

细胞命运决定及其表型分化是一个由转录因子介导的复杂过程，这些转录因子是调节细胞特征表型表达的正反馈或负反馈循环中的一员并发挥着重要的作用。miRNA可通过调节mRNA活性从而有效调控相关转录因子的表达，时刻影响着细胞的各个生理过程。影响间充质干细胞的成骨向分化及成骨前体细胞分化成熟的转录因子主要有Runx2，Osterix(OSX)及其他同源结构域蛋白，miRNA与转录因子间相互作用，构成复杂的调控网络，协调骨组织的生成[7]。

Runx2是成骨早期分化即表达的转录因子，其参与了BMPs, TGFs, Wnt, Hedgehog等多条通路调节的成骨细胞分化过程，上调的Runx2又可激活下游Osterix，Col I，ALP等成骨相关基因的表达[7-10]。Zhang发现在间充质组织成骨分化过程中，miR-23 a，miR-30c，miR-34c，miR-133 a，miR-135 a，miR-137，miR-204，miR-205，miR-217，miR-218和miR-338的表达与Runx2的表达呈负相关关系，其中除miR-218以外，其余miRNA均有抑制间充质组织成骨分化的作用[7]。Li用BMP-2诱导小鼠ST2细胞成骨分化时发现细胞内miR-2861表达增加，过表达miR-2861可增强BMP-2的诱导分化能力。miR-2861主要通过下调组蛋白脱乙酰酶5(Histone deacetylase 5, HDAC5)的表达从而抑制Runx2的降解，促进成骨分化[11]。后续研究又发现与miR-2861同基因座的miR-3960同样具有促进BMP-2成骨诱导的作用，其主要是通过下调Runx2的抑制蛋白同源盒蛋白A2(Homeobox A2, HOXA2)的表达实现的。反之，过表达Runx2又可促进miR-3960和miR-2861的表达，染色质免疫共沉淀结果显示Runx2可与miR-3960/ miR-2861的启动子结合，因此miR-3960/ miR-2861和Runx2构成正向反馈循环不断增强ST2细胞的成骨分化能力[12]。当使用BMP-2刺激C3H10T1/2细胞成骨分化时，细胞内雌激素受体相关受体(Estrogen receptor-related receptors, ERRs)和miR-433发生下调，而将miR-433表达上调后，过表达的miR-433可与Runx2 mRNA结合抑制BMP-2诱导的Runx2表达，阻断BMP-2的成骨诱导分化[13]。Tome报道，miR-335在人间充质细胞的分化过程中表达呈下降趋势，miR-335的表达受Wnt通路调控，上调miR-335的表达抑制间充质细胞的增殖，迁移及成骨和成脂分化，而Runx2可能是miR-335发挥作用的一个重要靶蛋白[14]。最近有研究显示，细胞在成骨分化过程中Dicer和Runx2的表达均上调，荧光素酶实验表明Runx2可促进Dicer的表达，Dicer的上调进一步促进成骨诱导相关miRNA表达的增加，因此Zheng提出Runx2/Dicer/miRNAs级联效应在细胞成骨分化及骨组织形成中扮演着十分重要的角色[15]。

OSX亦名Sp7，是诱导成骨分化的另一个重要转录因子，属Kmppel样家族的SP亚群，OSX敲除小鼠可因骨骼矿化异常在出生后即迅速死亡。miR-143可下调OSX的表达抑制MC3T3-E1细胞成骨分化[16]，miR-145抑制OSX表达后C2C12和MC3T3-E1细胞的成骨分化能力减弱[17]。在小鼠原代成骨细胞中过表达miR-93,发现，成骨细胞矿化能力明显下降，而使用OSX可逆转这一过程，研究表明miR-93仅影响了OSX的翻译过程，OSX mRNA水平无明显改变[18]。与之类似的，miR-31亦是通过下调OSX的表达从而抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化[19]。有研究发现，骨质疏松人群的骨髓间充质干细胞内miR-125b表达量明显上调，miR-125b可能是通过调节OSX的表达进而影响骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化[20]。miR-214可与OSX mRNA 3'UTR结合下调OSX表达，当给予miR-214抑制剂后，BMP-2诱导C2C12细胞成骨分化能力显著增强[21]。除此以外， miR-138，miR-142,miR-148和miR-637均可抑制OSX的表达，而miR-322可上调OSX表达水平[9, 22-24]。

2 miRNA与骨质疏松的关系

骨质疏松是以骨显微结构受损，骨矿成分和骨基质不断减少，皮质骨变薄，骨小梁数量下降，骨脆性增加和骨折危险度升高的一种全身骨代谢障碍性疾病。miRNA参与的表观遗传在骨代谢过程中发挥着重要的作用，极大程度地决定了相关细胞的分化方向，因此，骨质疏松的发生和miRNA的代谢紊乱具有密切的联系[25]。Chen检测绝经期妇女的血清发现 miR-30b-5p明显下调，而后Chen将这一结果在去势大鼠模型上进行验证，发现两者变化趋势一致[26]。在青少年特发性骨质疏松病例中，Li报道部分患者可能存在pre-miR-2861纯合突变[11]。通过对比去势手术小鼠和假手术小鼠的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal cells, BMSCs)，有研究发现miR-26 a在去势组的表达明显下降，该实验证实了miR-26 a对小鼠BMSCs的成骨诱导能力并肯定了miR-26 a作为骨质疏松的负向调控因子[27]。以上证据表明，骨质疏松的发生伴随着相关miRNA的代谢紊乱，而相关miRNA表达水平的变化又导致了骨代谢信号通路的改变。

BMP-Smad通路是间充质组织成骨分化过程中较为重要的信号通路之一，BMP-2与胞膜上BMP受体结合后特异性激活胞内Smad1/5/8,磷酸化的Smad1/5/8与Smad-4结合进入胞核，激活下游因子的转录过程。Xie发现miR-146 a可下调Smad4的表达，过表达miR-146 a抑制了BMP-2诱导的脂肪来源的间充质干细胞的成骨分化，使用miR-146 a抑制剂后成骨分化相关蛋白Runx2，OSX表达水平明显上升[28]。MiR-106b-5p和miR-17-5p通过抑制Smad5的表达使C2C12和MC3T3-E1细胞的成骨分化能力减弱，而在沉默骨质疏松小鼠体内miR-106b-5p和miR-17-5p的表达后，小鼠骨量水平得到明显改善，这一证据提示miR-106b-5p和miR-17-5p有望成为骨质疏松临床治疗的潜在靶点[29]。MiR-497～195簇属于miR-15家族，其表达水平随着成骨细胞的分化成熟不断增加，研究显示MiR-497～195簇具有拮抗BMP-Smad信号通路的作用，而Smad5是其作用位点之一[30]。MiR-100和miR-26 a可作用于Smad1从而抑制BMP诱导的成骨分化，但与miR-100不同的是，miR-26 a不仅作用于BMP-Smad信号通路，其还可作用于Wnt信号通路[31, 32]。

Wnt信号通路是诱导成骨分化的又一重要信号通路，miR-335-5p能与DKK1 mRNA 3’UTR结合并下调DKK1的表达，GSK-3β发生磷酸化，β-catenin转录活性增强，体内实验证实小鼠胚胎成骨细胞及肥大软骨细胞内miR-335-5p呈高表达状态[33]。miR-9可对DKK1进行转录后调控，过表达miR-9对C2C12细胞的DKK1转录无明显影响，但其蛋白表达水平明显下降，Wnt通路激活，成骨分化相关基因Col I，OCN，BSP表达上调[34]。miR-29 a在人间充质前体细胞系hFOB1.19及成骨细胞中均有表达并且对细胞的成骨分化过程至关重要，Wnt通路激活可诱导miR-29 a的表达，上调的miR-29 a又可下调Wnt通路抑制蛋白DKK1，Kremen2和分泌型卷曲相关蛋白2(secreted frizzled related protein 2, sFRP2)的表达，反向促进Wnt通路的激活，miR-29 a和Wnt通路二者构成正反馈调节不断放大成骨分化信号，促进间充质组织的成骨分化[35]。与之类似的，miR-218的表达受Wnt通路调控，上调的miR-218抑制硬骨素(Sclerostin，SOST)，DKK2和sFRP2表达，形成相似的正反馈调节循环，引导细胞成骨分化[36]。除以上信号通路以外，TGFβ-Smad，IGF，Hedgehog等信号通路在骨代谢过程中亦发挥着重要的作用，miRNA与这些信号通路之间的相互作用仍需深入研究。

在上述关于表观遗传机制的研究中，我们发现多种miRNA参与了骨代谢相关的信号通路调节。然而到目前为止，仅有部分miRNA在人体内或去势小鼠模型上得到验证，大量miRNA的体内效果仍不明确，其与骨质疏松症的联系有待进一步的探索，相关的研究将有助于促进我们对骨质疏松症的认识。

3 小结

miRNA作为转录后调控的重要一员，参与了细胞内众多转录因子的表达和调节通路的激活过程，在生物体的生长发育及疾病的发生发展过程中发挥着重要的作用。鉴于此重要性，近年来关于miRNA的研究已成为生命科学研究领域的热点。骨代谢相关miRNA时刻影响着骨质的新生与改建，miRNA表达异常与骨质疏松密切相关，通过对这些相关miRNA的深入研究，将有助于我们更好地了解骨代谢与骨质疏松的发病机制。然而，现阶段研究对于miRNA的认识仍十分有限，不仅有大量未知miRNA的功能仍需学者们的继续探索；对于已知的miRNA，其调控机制、下游靶mRNA的选择、表达时序性、与相关疾病的联系等问题亦需要深入研究。尽管如此，骨质疏松相关特异性表观miRNA标志物的识别将极大地促进骨质疏松症的临床诊断和治疗，而骨质疏松相关表观遗传调节机制研究则具有巨大的潜力。