糖化作用刺激体外重建全层皮肤模型中单核细胞分化

晚期糖化终末产物（AGEs）是由蛋白质或脂质与糖（如葡萄糖和核糖）通过非酶糖化反应形成的，是公认与自然老化相关机制之一。皮肤生物学研究认为，糖化作用对与真皮基质分子影响皮肤老化的硬化有关，可能是由改变分子间交联所致；有研究在糖尿病和老化皮肤中检测到AGEs蓄积。有文献报道，AGE沉积可使皮肤生物化学特性和功能均发生变化。AGEs通过改变细胞外基质和细胞内蛋白质，可影响皮肤自稳态和皮肤常驻细胞的功能。

AGE具有结合特异性膜蛋白能力，其中最著名且研究最多的为RAGE（AGE受体），该受体除了能与AGE结合，还能与参与炎症反应的S100蛋白、HMGB⁃1和Mac⁃1相互作用。AGE⁃RAGE结合可引起一种循环激活作用，即导致炎症性NFκB诱导的活化与RAGE上调之间的交互对话。这种激活作用可以增加促炎和促纤维化细胞因子和趋化因子的基因转录。角质形成细胞除外，RAGE可在不同类型的真皮细胞中表达，包括单核细胞/巨噬细胞、T淋巴细胞、内皮细胞、系膜细胞和成纤维细胞。有文献报道，在应对AGE修饰的细胞外基质时，成纤维细胞或角质形成细胞低表达RAGE，这些细胞能够表达其他AGE受体（如CD36）。其他AGE受体，如A类清道夫受体（SRA）；可在树突细胞、巨噬细胞和内皮细胞中表达。还有研究指出，SRA与RAGE之间存在交互作用，两种受体之间的拮抗在糖尿病视网膜病变的发病机制中发挥了作用。SRA过表达可抑制RAGE诱导的MAPK信号通路。反之，在缺乏SRA情况下，巨噬细胞中RAGE的激活有利于促炎反应出现。

当皮肤内稳态被破坏时，外周血中CD14+单核细胞进入真皮并分化为树突细胞和巨噬细胞。根据局部环境，这些细胞极化为促炎功能的M1巨噬细胞（CD68high）或具有组织重构、抗炎功能的M2巨噬细胞（CD163+、CD68low）。目前已经重新审视了常驻皮肤免疫细胞在皮肤内稳态中的作用，而该研究则旨在探讨老化进程中糖化作用与皮肤免疫细胞之间可能的相互作用。除了有研究报道AGEs具有延迟单核细胞凋亡，并诱导单核细胞向巨噬细胞形态分化的作用之外，关于皮肤环境中AGEs参与单核细胞分化进程的相关报道尚少。

为了解决这一问题，该研究整合了外周血CD14+单核细胞的体外重建全层皮肤模型（简称“重建皮肤模型”）中，探讨了糖化的真皮细胞外基质对单核细胞分化的影响，即为了应对环境条件的变化，单核细胞可能分化为树突细胞（BDCA1/CD1c、DC⁃LAMP/CD208）或巨噬细胞（DC⁃SIGH/CD209、CD68、CD163），并特别关注了巨噬细胞的极化分型。为了评价糖化基质条件下重建皮肤模型的生物学相关性，该研究对两个不同年龄组（年轻组，18～25岁；老年组，70～75岁）女性的日光防护部位皮肤活检样本的糖化状态和树突细胞或巨噬细胞数量进行了分析。

该研究在重建皮肤模型中首次证实，AGEs的存在可能是促进树突细胞和巨噬细胞分化的重要因素亦影响炎症过程。

一、材料和方法

（详见原文）

二、结果

1.在单核细胞存在的条件下，真皮等效物及重建全层皮肤模型形态和糖化作用的影响：该研究分别对真皮等效物和重建皮肤模型的形态学进行了观察。组织学检查结果显示，使用预糖化胶原蛋白构建的真皮等效物的形态与非糖化胶原蛋白构建的真皮等效物存在轻微差异，前者的胶原纤维特征更为明显。在真皮中，胶原蛋白没有被糖化修饰时，单核细胞保持球形状态。相反，当存在糖化胶原蛋白时，单核细胞似乎失去了它们的圆形结构，呈现出细长外观，这种形态的变化与表皮是否存在无关。在非糖化修饰或糖化修饰的胶原蛋白构建的真皮等效物中，无论单核细胞是否存在，重建皮肤模型的表皮形态和厚度均无变化。使用特异性抗体可以在糖化的重建皮肤模型的真皮明确地鉴定出CML AGE，但在非糖化时不能发现。

2.真皮AGEs增强重建的全层皮肤模型内单核细胞的分化：免疫检测结果显示，如同在正常皮肤一样，在重建皮肤模型的真皮中均能够观察到被添加的CD45+和CD14+细胞。在缺乏糖化作用情况下，可以观察到有限的CD14+单核细胞分化为树突样细胞（BDC1a+、DC⁃LAMP+）或巨噬细胞样细胞（CD14+、DC⁃SIGN+、CD68+、CD163+）。而伴随着糖化作用，CD14+单核细胞，BDC1a+、DC⁃LAMP+树突细胞，以及 DC⁃SIGN+、CD68+和CD163+巨噬细胞数量增加。无论在糖化或非糖化状态下，重建的全层皮肤模型单位内CD45+细胞数量占比约为15～20%时，除了DC⁃SIGN之外（趋向而非统计学意义），所有其他待检测的细胞数在糖化和非糖化状态下的差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，在表皮内未检测到阳性细胞。该结果表明，糖化状态的确有助于血单核细胞分化为重建皮肤模型真皮中树突细胞和（或）巨噬细胞。

3.真皮内巨噬细胞数量随年龄的增长而增加：对年轻人和老年人组的皮肤活检样本进行对比分析。观察到AGEs随年龄增长在皮肤内出现蓄积，且DC⁃SIGN+、CD163+阳性巨噬细胞细胞数量呈年龄相关性增加。值得注意的是，在预糖化胶原蛋白存在的条件下，重建皮肤模型中这两种标志物也增加。该结果提示，AGEs随年龄的增加与刺激单核细胞分化为树突细胞和巨噬细胞表型之间可能存在关联。

4.AGEs受体在单核细胞系中表达，在成纤维细胞中不表达：研究结果显示，在非糖化或糖化的重建皮肤模型中，RAGE和SRA这两种AGEs受体几乎在所有的CD14+细胞中均有表达，而在成纤维细胞（CD14-）中罕有表达。

三、讨论

该研究发现，外周血CD14+单核细胞在体外皮肤环境中能够分化为树突细胞和巨噬细胞。该研究通过直接添加CD14+单核细胞，并在非糖化或在预糖化的胶原蛋白存在的条件下将其与成纤维细胞共培养，来获得真皮等效物，随后添加角质形成细胞之后获得重建的全层皮肤模型。预糖化胶原蛋白可以使更多的单核细胞存活并分化为树突细胞或巨噬细胞。该研究通过这种重建皮肤模型首次证实，在AGEs存在的情况下，能够维持和影响真皮内单核细胞衍生（CD45+、CD14+）细胞数量。该体外结果与那些随年龄增长而在人类皮肤中发现的现象具有相关性。实际上，有研究者发现真皮内单核细胞衍生的细胞数随年龄增长而增加。这些来自于单核细胞系的细胞能够通过成纤维细胞合成的几种因子而保留在真皮内。已有研究证实，AGEs对单核细胞可以产生趋化作用，亦有报道表明与AGEs接触的内皮细胞可以释放趋化因子MCP⁃1（单核细胞趋化蛋白1）。同样，AGEs可以延迟人外周血单核细胞的凋亡，反之能够促进这些细胞及其衍生细胞在组织中的蓄积。在AGEs存在的条件下，单核细胞系细胞似乎遵从向树突细胞和巨噬细胞分化的路径。该研究证实，由预糖化胶原蛋白构建而成的重建皮肤模型中的BDC1A+（未成熟的树突细胞和巨噬细胞）、DC⁃LAMP+（成熟的树突细胞）和DC⁃SIGN+、CD68+和CD163+（巨噬细胞）比对照组（非糖化）有所增加。在部分人皮肤中也可以发现由老化引起的这类改变。同样，还有报道描述了AGEs对单核细胞转化为成熟树突细胞的影响，以及单核细胞分化为不同表型巨噬细胞的影响。在受到AGEs的刺激后，单核细胞和巨噬细胞能够合成炎症因子或促炎性细胞因子（如白介素1⁃β、白介素8、肿瘤坏死因子α或前列腺素E2），或增加由基质金属蛋白酶（如MMP⁃9）诱导的细胞外基质的降解。在该研究的重建皮肤模型中发现，RAGE和SRA这两种AGEs受体在CD14+细胞上呈现高表达。已有报道表明，这些受体尤其是RAGE，存在于单核细胞或巨噬细胞的表面，可诱导MMPs和炎症因子的分泌。在未来将进一步对这些受体进行研究。相对于短期2D的单层细胞培养，该研究中3D共培养21 d的重建皮肤模型不仅可以实现单核细胞分化为促炎M1巨噬细胞，还能够实现其分化为具有重构功能的M2巨噬细胞，提供了一个更接近于体内研究的生理状态。这表明微炎症过程与重构过程是一分为二的状态，这两种效应均存在于慢性炎症过程中，且在皮肤老化中也有报道。

该研究证实，单核细胞系的CD14+细胞能够分化为树突细胞或巨噬细胞，这一过程会受到真皮糖化状态的影响。鉴于这些事实，明确这些单核细胞衍生的细胞在皮肤中是否真正对慢性微炎症过程有帮助，或者是否通过分泌抗炎性可溶因子，如IL10选择性维持自稳态会很有意思。

［陈旭 周治君摘自Pageon H,Zucchi H,Rousset F,et al.Glycation stimulates cutaneous monocyte differentiation in reconstructed skinin vitro［J］.Mech Ageing Dev,2017,162:18⁃26.］