黄颡鱼性腺发育的季节性变化

杨丽冬，林绮媚，舒 琥*

(1.岭南师范学院基础教育学院，广东湛江 524037；2.广州大学生命科学学院，广东广州 510006)

黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)属鲇形目(Siluriformes)，鲿科(Bagridae)，黄颡鱼属(Pelteobagrus)[1]，俗称江颡、盎斯鱼、嘎芽子等，其体重30～100 g，体长11～19 cm。黄颡鱼是温水性鱼类，在缓流或静水底层分布居多，天然水域分布较广，生存温度为0～38 ℃，适应性非常强，对外界环境和营养等要求不高，遍布于我国大部分天然水域，为我国独特的优质品种[2]。黄颡鱼味美且肉嫩，其药用价值巨大，滋补效果更甚，深受消费者喜爱，被一致归为高档鱼。黄颡鱼在东南亚、日韩等国家经济价值高，市场潜力巨大，因此成为优质的出口品种之一。然而商品黄颡鱼长期依赖人为捕捞，再加上饲料和种苗来源等问题的存在，黄颡鱼人工繁殖历史较短。

目前，国内外已有很多与黄颡鱼性腺相关的研究报道。现如今对于黄颡鱼雌鱼的产卵类型有2种不同的观点，其中李明锋[3]认为黄颡鱼是一次产卵型鱼类，而胡成钰等[4]、王卫民[5]认为其是分批产卵型鱼类。另外，鲇形目鱼类的精液在生殖季节不能被挤出[6]，因而限制了黄颡鱼的人工繁殖。研究黄颡鱼雌鱼的产卵类型和黄颡鱼雄鱼精巢的结构特点，有助于其人工苗种繁殖发育。

1 材料与方法

1.1材料黄颡鱼来自番禺的国家罗非鱼良种场，选择鱼体色发红的雌鱼作为母本，通过催产的方式取母本亲鱼卵，挑选健康强壮、有光泽、卵粒偏黄且大的卵；与此同时，挑选健康无病的雄鱼作为父本，取精巢将之切碎，混合鱼卵受精。将受精卵均匀地撒遍网上，放入水质好的鱼池中。2～3 d后仔鱼孵出，60～90 d后仔鱼性成熟。在当年的3、6、9、12月份分别取雌性和雄性的黄颡鱼性腺2～3个。

1.2方法

1.2.1样品固定及处理。 性腺用Bouin’s溶液固定后进行一系列乙醇脱水，加之二甲苯透明，石蜡包埋步骤后，用LeicaRM2135型切片机对样品进行连续切片(厚度8～25 μm)，随后经过H-E染色，用中性胶封片后保存，最后通过Leica显微镜观察镜像并摄像保存。对其性腺的分期以刘筠[7]采纳的鲤科鱼分期为参照标准。

1.2.2性腺成熟系数计算方法。 性腺成熟系数=性腺重量/鱼体重量×100%，试验所测数据均采用Excel(2003)和SPSS(12.0)软件进行整理及统计分析。

2 结果与分析

2.1卵巢发育的形态学及组织学分期黄颡鱼的卵巢前部略大、后部相对较小，为左右一对长囊状结构，位于肾脏和鳔的腹侧面，左侧和右侧卵巢中后部相连，与生殖孔有相同的接口，随后开口朝向体外。卵巢分期主要是基于卵细胞的生理、形态特征的发育以及组织学成分来区分卵巢本身。最重要的基础之一是卵细胞所处时期或成熟度，所以根据黄颡鱼卵巢发育的色泽、形态、卵细胞成熟度及大小，可将其分为6个时期，其中Ⅰ期卵巢终身只出现1次，该试验所取样品没有发现Ⅰ期卵巢，其余如下。

2.1.1Ⅱ期卵巢。出现于12月份，卵巢外观扁囊状且泛红，呈半透明，用Bouin’s溶液固定后观察较为清晰，卵巢宽3.2 mm，长31.0 mm，重0.47 g，鱼体长163 mm。这个时期处于卵原细胞不再进行有丝分裂，转移到细胞核和细胞质进入增长阶段，这个发育期有一部分卵巢Ⅰ期卵原细胞，但主要是Ⅱ期卵母细胞。Ⅱ时相卵母细胞的显著特征是：①卵黄核出现在细胞质中；②细胞质呈现碱性反应，用苏木精染料染成紫蓝色；③单层滤泡细胞包绕在细胞外。根据卵黄核(图1f)将其分为前期(Ⅱ+)、中期(Ⅱ++)、后期(Ⅱ+++)3个部分(图1h)。前期：卵母细胞显然比卵原细胞大些，细胞核直径是14.0～26.0 μm，卵子直径是26.0～34.0 μm，中心大核仁缺失，小核仁分布在细胞核(8～24个)，没有看到明显的卵黄核，而卵原细胞有丝分裂停止，除了Ⅱ+期卵母细胞的卵巢外，还有很多Ⅰ期卵原细胞。中期：细胞体积有所增大，核径为20.0～32.0 μm，卵径为32.0～48.0 μm，核仁数量增加到28～30个，细胞质呈碱性，且细胞质靠近细胞核的边沿，有明显的卵黄核。后期：卵黄核转移到附近皮质(图1g)，细胞体积增大，这相当于Ⅱ时相转变为Ⅲ时相的过程，此时核直径是32.0～45.0 μm，卵子直径是45.0～83.0 μm。卵巢在产后恢复到Ⅱ期时含有大量Ⅱ时相小卵粒。

2.1.2Ⅲ期卵巢。在3月和9月，出现淡黄色、长囊形的卵巢，肉眼可见的卵粒位于性腺中。卵巢膜血管丰富，这一过渡时期是由初级卵母细胞的生长阶段从小到大最终形成卵黄的过程(图1a)。270～300 d龄鱼处于这个时期，而且每年3月份达到性成熟年龄的鱼类也在这期间，而这个发育期在短时间内其整个成熟过程中卵巢一般只有20～30 d。这期间性腺宽3～5 mm，重1.08 g。其主要特点是：①原1层滤泡细胞分成2层，外侧细胞通常为扁平形，而内侧细胞通常为立方形；②由于滤泡细胞分泌使卵和滤泡膜间形成薄膜，为放射膜；③核膜与细胞膜之间的细胞质被一圈染色较深且不规则的带状细丝分成两个部分(图1b)，接近卵细胞膜的细胞质结构紧密，染色深，紧挨着核膜的细胞质排列松散，染色浅，呈网索状，所以需要对这特殊结构和卵黄生成作用之间的关系进一步研究。Ⅲ期卵细胞大小增加显著，细胞核直径为41.5～158.0 μm，卵直径为82.0～301.5 μm，核仁数增加到33～47个。

2.1.3Ⅳ期卵巢。9月份出现，此期卵巢呈淡黄色，卵巢囊状肿胀，卵显著增大。众多卵粒粘连聚集在一起但没有游离，此期大多数卵母细胞均处Ⅳ时相，少数处Ⅲ时相(图1d)。 卵巢宽度为8 mm左右，重3.26 g，卵巢内卵黄颗粒众多，310 d的鱼还有大约9月份产后雌鱼的卵巢属于这时期。以卵的大小、胚核位置以及卵黄累积状况为依据，将卵母细胞中Ⅳ时期划分成早期(Ⅳ+)(图1d)、中期(Ⅳ++)、晚期(Ⅳ+++)。早期：大多数卵母细胞呈球形，而卵母细胞Ⅲ期中没有带状细丝，细胞核在细胞中央位置，有双层滤泡细胞，细核膜周围遍布许多卵黄颗粒，卵径为345.0～500.0 μm。中期：细胞质整个遍布卵黄颗粒，大多数卵细胞呈橄榄状，细胞核居细胞中央，卵巢短径为210.0～705.0 μm，长径为500.0～950.0 μm，卵巢成熟系数为0.19%～0.49%。晚期：胚泡似乎偏离了原始位置，朝动物极方向移动(图1e)，极性的卵母细胞出现。辐射膜和滤泡细胞更清晰可见，证明已经发育成熟，这是最敏感的时期，可通过使用外源激素人工催产素进行催产，为了使黄颡鱼催产达到预期的效果，需要把握好卵母细胞的成熟时间。

2.1.4Ⅴ期卵巢。出现于6月份，橙黄色卵巢遍布卵粒，6月份性成熟的鱼和330 d龄后的鱼处于此期。Ⅴ期卵母细胞划分成早期(Ⅴ+)和晚期(Ⅴ++)。早期卵黄在细胞质中完全遍布，生发泡已经消失，未能产出卵粒。晚期游离状的卵粒(图1c)，雌鱼腹部经轻压后排出少量卵，卵遇到水后立即扩张，黏度增加，因此黄颡鱼鱼卵属于黏性卵，次级卵母细胞在此期间已有受精能力，也可以称卵子，证明卵巢生理成熟。卵巢短径为600.0～875.0 μm，长径为710.0～1 200.0 μm，卵巢成熟系数为0.60%～1.33%。

2.1.5Ⅵ期卵巢。6月份出现卵巢为浅黄色，由于卵子的产出导致体积显著缩小并软化，且发现黄色卵粒中有白色卵粒的现象，可能是卵巢中发育不成熟而没产出退化的卵。空滤泡细胞在产后残留下来，其他大部分属Ⅱ时相。

2.2卵巢发育的季节性变化黄颡鱼的卵巢发育明显为季节性的，3月份卵巢开始逐渐发育，卵巢是Ⅱ期卵巢向Ⅲ期卵巢过渡，并主要为Ⅲ期卵巢。6月份卵巢发育最为成熟，以Ⅴ期和Ⅵ期卵母细胞为主，因此是进行人工育种最好的季节。9月卵巢到了产后修整期，而且部分卵母细胞又开始发育，以Ⅲ期和Ⅳ期卵母细胞为主。12月份卵巢经退化后又恢复到Ⅱ期，一个新的生理周期又开始运转。表1为黄颡鱼雌鱼周年变化。

表1 黄颡鱼雌鱼周年变化

注：同列数据后小写字母不同表示差异显著(P< 0.05)

Note：Different small letters within the same column mean significant differences(P< 0.05)

2.3精巢发育的形态学及组织学分期黄颡鱼的1对精巢，借系膜伴随身体的两侧位于消化道背面以及鳔的腹面。从外观上看精巢可分为两部分：上部为左右各1个长约4 cm乳白齿形的生精区(能产生正常的精子)，每一头各有26个左右叶状分支结构，叶状分支基底宽平随后逐渐减少。在基底处叶状分支合并进入输出管，往下部方向运送精子。储精囊的下部分(不能产生精子，精子存储功能)，长度仅是生精部的1/2，呈淡红色。储精囊由两侧生精区在临近肾脏尾端处合并，形成输精管。两侧的输精管纤细，有14对指状分支。输精管在肌肉质尿殖突口开放。黄颡鱼精子形成类似于其他鱼类，包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞以及成熟精子5个阶段[8-12]。根据其组织学分析精巢分为6个时期，其中Ⅰ期精巢终身只有1次，且只有30～60 d龄的雄鱼处于此阶段，该试验所取样品的雄鱼日龄已超过60 d，没有发现Ⅰ期精巢，其余如下。

2.3.1Ⅱ期精巢。出现于12月份，精巢开始变粗(图2g)，肉眼可以看到小齿状分支，半透明且血管不清晰，此时精巢宽度也开始增加。来自精原细胞(图2h)的有丝分裂显示精原细胞数量显著增加，其中约10个细胞聚集成团以组成圆形/椭圆形初级精细小管，细胞直径为4.3～7.2 μm，核直径为1.8～2.9 μm，核嗜碱性，核膜清楚可见，60～130 d龄及产后12月份的鱼处于此时期。

注：a.3月卵巢，示卵母细胞，×50；b.3月卵巢，示带状细丝，×200；c.6月卵巢，示成熟的卵子(黑色箭头)和核偏位(白色箭头)，×50；d.9月卵巢，Ⅲ时相和Ⅳ时相卵母细胞共存，示Ⅳ+卵母细胞，×50；e.9月卵巢，示卵母细胞，核位于中央，×200；f.12月卵巢，示卵黄核，×50；g.12月卵巢，卵母细胞中的卵黄核接近核膜，×200；h.12月卵巢，示Ⅱ+(白色箭头)、Ⅱ++(黑色箭头)卵母细胞，×100Note：a.ovary in March，showing oocytes，×50；b.ovary in March，showing ribbon filaments，×200；c.ovary in June，showing mature eggs(black arrow) and nuclear deviation(white arrow )，×50；d.ovary in September，phase Ⅲ and phase Ⅳ oocytes coexist，showing Ⅳ+ oocytes，×50；e.ovary in September，showing the oocyte，the nucleus is located in the center，×200；f.ovary in December，showing yolk nucleus，×50；g.ovary in December，the yolk nucleus in oocytes close to the nuclear membrane，×200；h.ovary in December，showing Ⅱ+(white arrow) ，Ⅱ++(black arrow ) oocytes，×100图1 黄颡鱼卵巢发育的季节性变化Fig.1 Seasonal changes in ovarian development of P.fulvidraco

2.3.2Ⅲ期精巢。出现在3月份，表面看是白色有点红，有明显增大的指状分支和清晰可见的血管，并且细管腔出现在精细小管内(图2a)，部分精原细胞位于精细小管内，此外初级精母细胞、次级精母细胞在盆腹腔聚集成很多层细胞，其细胞体积小，细胞直径为1.9～4.1 μm，核直径为1.5～2.3 μm，出现模糊不清的核膜，少量精子细胞位于盆腹腔中央区域(图2b)，超过130 d龄和3月份性成熟的鱼均属这一时期。

2.3.3Ⅳ期精巢。出现在9月，表面看是白色的，有清晰可见的血管和很薄的壶腹壁膜(图2e)，壶腹部主要是精子细胞，少数精原细胞以及初级精母细胞位于腹壁边缘，具有很强的嗜碱性，所以细胞被染成深蓝色，精子细胞直径为1.6～2.8 μm，核直径为0.7～1.3 μm，少量成熟精子分布在其间(图2f)。

2.3.4Ⅴ期精巢。出现在6月和9月，精巢是乳白色分支非常圆厚完整的(图2c)，但其血管不能清楚分辨，即使对亲鱼腹部进行按压，也很少或根本没有精液流出。通过切片观察到，精子细胞已经彻底成为完全成熟精子(图2d)，损伤的壶腹壁以及从小叶腔中释放的精子旋转流动成一片。在这期间精子具有非常强的嗜碱性，经过苏木精染色而成蓝色。

注：a.3月精巢，×50；b.3月精巢，示精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞，×200；c.6月精巢，×50；d.6月精巢，示成熟精子，×200；e.9月精巢，精子排放后，精巢内部有空隙，×50；f.9月精巢，示排精后精小囊内残存精子，×200；g.12月精巢，内部变回饱满，×50；h.示精原细胞，×200；sg.精原细胞；psp.初级精母细胞；ssp.次级精母细胞；st.精子细胞；sp.成熟精子Note：a.testis in March，×50；b.testis in March，showing spermatogonia，primitive spermatocyte and secondary spermatocyte，×200；c.testis in June，×50；d.testis in June，showing mature sperm，×200；e.testis in September，sperm emissions，the testes within a gap，×50；f.testis in September，showing spermatogenic spermatozoon residual sperm within the small sac，×200；g.testis in December，the internal change back to full，×50；h.showing spermatogonia，×200；sg.spermatogonia；psp.primitive spermatocyte；ssp.secondary spermatocyte；st.spermatid；sp.spermatozoon图2 黄颡鱼精巢发育的季节性变化Fig.2 Seasonal changes in testis development of P.fulvidraco

2.3.5Ⅵ期精巢。出现在6月，表面看是象牙白色分支有所缩小状，细管状精子从精细小管内排出，所以在繁殖季节(6月)后，观察精巢切片，显示还有很多精子和精子细胞位于壶腹腔内。

2.4精巢发育的季节性变化黄颡鱼的精巢发育也呈明显的季节性变化，黄颡鱼精巢在3月份开始发育，然后逐渐成熟，到了6月份，雄鱼的排精量最多，生殖力最高，有高峰，然后在9月份下降，精巢在12月份开始恢复饱满，接着在3月份又开始恢复，一个新的生理周期又开始运转。表2为颡鱼雄鱼周年变化。

表2 黄颡鱼雄鱼周年变化

注：同列数据后小写字母不同表示差异显著(P< 0.05)

Note：Different small letters within the same column mean significant differences(P< 0.05)

3 讨论与结论

3.1黄颡鱼雌鱼的产卵类型关于黄颡鱼的产卵类型，现如今有2种不同的观点，李明锋[3]认为是一次产卵类型，而胡成钰等[4]、王卫民[5]认为它是分批产卵类型，该研究结果表明黄颡鱼应为分批产卵类型，其原因是基于卵巢周年切片观察，产后9月的卵巢中，大多数为Ⅲ期卵母细胞和一些Ⅳ期卵母细胞，有少数Ⅰ、Ⅱ期卵母细胞，因此可以进行第2次排卵。

3.2黄颡鱼精巢的结构特点黄颡鱼精巢具有以下特点：精巢的形状平坦，显然从形式和功能上分成两个组成部分。生精区位于上部，储精囊在下部。上下两部高度分支，储精囊内的输精管远长于非鲇形目鱼类。对比鲇形目其他鱼类，大多数鲇形目其他鱼类精巢常见的特征黄颡鱼精巢均具有。鲇形目鱼类精巢通常是分支的，长吻鮠精巢的分支更特别，其分支之上还具有分支[13]。而南方鲇精巢无明显周年变化，全年可产精子[14]；革胡子鲶等鱼的瓣状精巢虽然已经成熟，但精液不能被挤压出来[15]。对比非鲇形目鱼类[16]的形态黄颡鱼精巢有非常大的区别，非鲇形目鱼类精巢为细线状或直棍状，呈小叶型，有疣状突起，无分支，没有储精囊和典型输精管。黄颡鱼精巢呈扁平状，生成少量精子和长而高度分支的储精囊，导致在繁殖季节黄颡鱼的精液尚未被挤出，而在生殖季节，非鲇形目鱼类的精巢可生产出众多精子，其排出体外只需通过短输精管即可，所以在生殖季节中精液可以被挤出。

3.3黄颡鱼人工繁殖需要掌握理想时期黄颡鱼适应性强、成活率高、生长速度快、经济价值高，使其成为我国重要的淡水经济鱼类。因此，黄颡鱼养殖业迅速发展，开始了大规模的人工繁殖[17]，但还存在一些困难，除了技术难点外，黄颡鱼生殖习惯和生理结构也有着重要的关系：①黄颡鱼雄性亲鱼精巢呈树状分支，在黄颡鱼性成熟的季节要进行人工催产、人工受精，不能像其他鱼类用力挤压腹部促进排精，而是要杀死雄鱼，去除精巢，切碎，以进行人工授精。如果不掌握好雄鱼精子的成熟时间，会造成人工繁殖失败，劳动强度增加，而且提高成本。②黄颡鱼雌鱼是分批产卵类型，掌握好雌鱼第1、2次排卵时间，可以增加产量。近年来，随着黄颡鱼人工繁殖技术的突破，全雄黄颡鱼养殖规模逐渐扩大。通过人工培育亲鱼提高精卵质量、调控生态因子等方式，黄颡鱼人工繁殖效率大大提高[18]。

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