胶质瘤微环境相关研究

李洵 艾文兵

[摘要] 胶质瘤是最常见的成人原发性颅内恶性肿瘤。当前治疗手段包括手术、放疗和口服化疗药物替莫唑胺。这些治疗手段均有一定的治愈率，但仍有复发的可能，主要是由于肿瘤细胞在肿瘤治疗过程中仍能存活并能够重建肿瘤。因此，明确调节肿瘤细胞这一活动的分子机制对于肿瘤的治疗至关重要。胶质瘤干细胞（GSC）对常规放化疗耐受可能是胶质瘤易复发的原因之一。GSC所处的肿瘤微环境与GSC的发生发展有关，这也为胶质瘤的治疗提供了一个全新思路。本文重点综述了GSC相关肿瘤微环境的研究进展及通过靶向微环境治疗胶质瘤。

[关键词] 微环境；胶质瘤；胶质瘤干细胞；靶向治疗

[中图分类号] R739.41 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（a）-0033-04

Research on glioma microenvironment

LI Xun1 AI Wenbing2

1.Medical College of China Three Gorges University， Hubei Province， Yichang 443000， China； 2.Yiling Hospital of Yichang City， Hubei Province， Yichang 443000， China

[Abstract] The glioma is the most common primary intracranial malignancy in adults. Current treatments include surgery， radiotherapy， and oral chemotherapy drug temozolomide. These treatments have a certain cure rate， but there is still the possibility of recurrence. The main reason is that tumor cells can survive and rebuild tumors during the treatment. Therefore， it is essential for the treatment of tumors to know the molecular mechanism that regulates the activity of tumor cells. Glioma stem cells （GSC） tolerance to conventional radiotherapy and chemotherapy may be one of the causes of glioma recurrence. The tumor microenvironment in which GSC located is related to the development of GSC， which also provides a new idea for the treatment of gliomas. This article focuses on the research progress of GSC-related tumor microenvironment and the treatment of gliomas through targeted microenvironment.

[Key words] Microenvironment； Glioma； Glioma stem cell； Targeted therapy

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤。采用手术、大剂量化疗和放疗等综合措施治疗能取得较好的治疗效果，但其总体预后仍较差，尤其是恶性程度较高的胶质母细胞瘤。胶质瘤干细胞（GSC）在胶质母细胞瘤对抗常规治疗以及肿瘤复发中可能起关键作用。此外，GSC所处的肿瘤微环境与GSC的发生发展有关，这为胶质瘤的治疗提供了一个全新思路。本文重点综述了GSC相关肿瘤微环境的研究进展及通过靶向微环境治疗胶质瘤。

1 胶质瘤临床治疗现状

胶质瘤是最常见的成人原发性脑肿瘤，胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是恶性程度和死亡率最高的胶质瘤亚型。目前胶质瘤常规治疗手段是手術大部切除并辅以放疗和替莫唑胺化疗，但患者的预后较差。研究发现[1]，GBM中存在胶质瘤干细胞亚群（glioma stem cell subpopulation，GSCs），对化疗和放疗具有较强的抗性，提示GSCs可能是GBM治疗失败和高复发率的原因。GSCs被认为是胶质瘤治疗的重要靶标，通过靶向与GSCs发生发展密切相关的微环境是否可以特异性杀伤GSCs有待深入研究。了解GSCs与微环境相互作用的机制可以为胶质瘤的治疗提供新的思路。

2 胶质瘤干细胞微环境研究

GSC的特征维持和功能发挥与其所处的微环境密切相关。目前认为胶质瘤复发主要是由GSC引起，分离的GSCs表现出耐受化疗与放疗的特性，表达高水平的干细胞细胞标志物，且具有高度侵袭性。GSC具有自我更新和不断增殖的能力，在肿瘤细胞亚群中占少数。GSC在血管丰富和缺氧微环境区域聚集并高表达干细胞表面标志物如CD133和CD44。颅内注射CD133+ GSC细胞使肿瘤侵袭性增强[1]。另外，CD133+GSC细胞经放疗后增多，并且CD133的高表达往往预示着患者较差的预后[2]。同样，CD44也具有增强GSCs发展的作用[2]。现有研究表明[3]，与GSCs发生发展密切相关的微环境主要有两种，即缺氧微环境和血管周围微环境。以下本文将进一步论述缺氧微环境和血管微环境与胶质瘤干细胞的关系。

2.1 胶质瘤血管微环境有助于GSC特性维持

GBM能通过增殖内皮细胞（EC）促进微血管增生。血管的生成对于肿瘤的发生发展至关重要。GSC通常在富集肿瘤血管的微环境中聚集；GBM肿瘤的免疫组织化学染色显示，CD31+ EC周边有CD133+ GSCs的聚集[4]。GSC通过分泌血管内皮生长因子（VEGF）诱导EC迁移和血管生成，进而促进肿瘤发生[4]。血管生成对于GSCs功能维持的重要性在抑制VEGF生成的临床前期研究中得到证实[4]，血管内皮因子抗体贝伐单抗能消耗肿瘤脉管系统和特异性地抑制由GSC衍生的异种移植物在小鼠体内的生长。GSC通过CXCL12/CXCR4配体/受体结合诱导分泌VEGF[5]。CD133+ GSCs通过CXCL12相关的PI3K/Akt途径促进VEGF的生成[5]。CXCR4拮抗剂与PI3K抑制剂LY294002可以减少肿瘤VEGF的产生和抑制由GSC诱导形成的肿瘤异种移植物的生长和血管生成[5]。此外，抑制CXCR4信号传导能够抑制GSCs的侵袭性和使肿瘤细胞对放射治疗敏感[6]。内皮细胞能够分泌几种促进GSCs存活和侵袭性的因子[4]。例如，血管生成素（Ang1）-Tie2受体相互作用在维持GSCs侵袭性中起关键作用[5]。由EC衍生Ang1与酪氨酸激酶Tie2受体作用能促进GSC上黏附蛋白的表达，包括N-钙粘蛋白和整合素β1，从而促进GSC侵袭[7]。整合素β1对GBM弥漫浸润至关重要。此外在血管微环境中，由CD31+ ECs分泌的Shh分子通过激活Patched1和GLI信号通路以促进体内GBM肿瘤生长和GSC的自我更新[7]。抑制Shh-GLI信号能减少GSC自我更新和体内肿瘤发生，提示Shh对GSC的生存很重要[4]。GSCs可以与微环境中的血管细胞相互作用，这种相互作用能够维持和促进肿瘤生长并促进血管生成[4]。L1CAM是一种神经黏附分子，能够调节肿瘤细胞的生长和迁移，在GBM中过表达，并且是GSC存活和增殖必需的[6]。GSC直接与ECs相互作用诱导EC迁移，并促进血管生成通过L1CAM-整合素αvβ3通路[8]。敲除L1CAM会导致Olig2表达下调，使GSCs的扩散和功能维持被抑制。此外，激活的Notch信号能增强GSC的自我更新和侵袭性[9]。GBM免疫荧光染色证明GSCs表达高水平的Notch1和Notch2受体与邻近的ECs密切相关[9]。EC表达Notch受体的配体DLL4和JAGGED1GSCs，通过与Notch受体作用而促进GSC的自我更新[9]。EC分泌的一氧化氮也能活化Notch信号，导致GSC自我更新增强和诱导胶质瘤发生；用γ-分泌酶抑制Notch信号传导可导致GSC自我更新减少[9]。在血管微环境中消除ECs能减弱GSC对辐射治疗的抗性。

2.2 缺氧因子诱导GSC的生存

缺氧在肿瘤的发生、转移、侵袭和治疗耐受中起关键作用。健康脑组织中氧气浓度范围为12.5%～2.5%（PO2=200～100 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa），绝大多数GBM存在不同程度缺氧，其氧气浓度介于2.5%～0.5%[10]。从缺氧区迁移出来的GBM检测出高水平的GSC标志物。GSC通常位于肿瘤坏死区周围，缺氧的环境可以促进和维持其干细胞特征及其耐药性[11]。细胞对缺氧微环境的反应很大程度上受到缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）的转录因子调节。HIF-2α的表达随着缺氧程度增加而增强，CD133表达与其相关，并且HIF-2α能够提高GSCs的自我更新能力。HIF-2α在GSCs中诱导干细胞标志物表达，包括Sox2、Oct4和c-Myc[12]。缺氧还可诱导HIF-1α的表达，HIF-1α的高表达能增强胶质瘤细胞的侵袭能力[13]。由缺氧介导的HIF-1α激活Notch途径是维持GSCs特性所必需的。抑制HIF-1α或Notch通路能抑制缺氧介导的维持GSCs特性能力[14]。此外，HIF-1α还可以稳定Notch蛋白的胞内结构域，从而激活Notch信号通路[14]。与之类似，Wnt通路的相关蛋白也出现高表达，其与肿瘤的侵袭及增殖等密切相关。研究表明[15]，低氧促进Wnt通路表达，从而促进胶质瘤细胞的增殖。事实上，由缺氧介导的Notch通路激活能导致E-钙粘蛋白表达所引起的肿瘤细胞入侵能力减弱。因此，抑制Notch表达能阻断由低氧所诱导的肿瘤侵袭，从而促进GSC凋亡[14]。

3 以微环境为靶点治疗胶质瘤

3.1 以血管微环境为靶点治疗胶质瘤

据报道[16]，GSCs能释放高水平的VEGF，促使新生成EC迁移到肿瘤并促进血管生成。成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor 2，FGF-2）有助于保持GSCs的干性，从GSCs细胞系中敲除FGF-2，导致GSCs分化[1]。内皮介导的信号传导途径的研究揭示了雷帕霉素（mTOR抑制剂）可能是重要的靶点治疗组成[16]。抑制mTOR（藥理学上用雷帕霉素，PP242和PI103，或用siRNA）能终止内皮细胞介导的GSC发生和发展[16]。通过GSC与内皮细胞的颅内共植体观察到肿瘤生长显著加速，并且CD133+ GSC的数量显著增加[4]。贝伐单抗是一种抗血管生成剂，通过抑制VEGF起作用，消耗肿瘤脉管系统，从而显著减少肿瘤CD133+ GSC的数量；同时也能显著减小肿瘤大小[4]。初步观察指出，源自CD133+ GSC植入的肿瘤伴有显著增多的血管，并且通过检测VEGF，发现GSC主要通过VEGF促进血管生成[17]。抗VEGF抗体贝伐单抗抑制GSC对内皮细胞的影响并抑制肿瘤生长[18]。VEGF特异性单克隆抗体贝伐单抗能阻断VEGF与VEGFR2的结合，从而抑制血管生成[19]。然而，有学者指出VEGF拮抗不足以抑制新的GSCs血管微环境形成，因为它能增加FGF1、FGF2和CXCL12等促血管生长因子的表达和补充骨髓衍生细胞促进血管生成[20-21]。研究也显示了通过ATRA抑制VEGF，随后的研究发现GSC培养物表达高水平的基质衍生因子-1（SDF-1）；用小分子SDF-1拮抗剂处理的胶质瘤小鼠（AMD3100）体内血管生成被显著抑制[22]。抗血管生成和细胞毒素治疗的组合能够抑制GSC生长，这在进行的临床试验以测试单独使用抗VEGF药物和联合细胞毒药物治疗的实验中得到证实。目前，通过抑制血管生成、靶向血管微环境的疗法被认为是一种比较有应用前景的治疗方法，其主要是通过减少血管生成直接阻断血液营养物质向肿瘤组织的输送。

3.2 以缺氧微环境为靶点治疗胶质瘤

在GBM中，缺氧与患者预后不良相关，这亦是干细胞所处微环境的重要性之一[23]。缺氧促进GSCs自我更新、增殖以及致瘤性，并诱导非GSC获取干细胞特性。缺氧刺激HIF家族的表达，导致促血管生长因子的产生。因此，缺氧微环境在GSCs的维持和扩增中具有关键作用[1]。在缺氧环境中，神经干细胞促进HIF-1a表达，其反过来上调VEGF的表达以刺激血管生成并使微环境重新正常化[24]。VEGF的阻断剂可部分逆转由HIF-1α表达增加所引起的作用[24]。缺氧可以增加GSC干性并且使GSC干细胞表面标志物（如CD133、A2B5、Nestin、Oct4和Sox2）上调，并使分化标志物（例如神经胶质纤维酸性蛋白）的表达下调[25]，使GSC增殖速率和自我更新的能力也显着增加[26]。在严重缺氧情况下，HIF-1α和HIF-2α在GSC中的表达上调[25]。缺氧程度影响缺氧诱导因子的表达，在较温和的缺氧（即7%的氧气）与最低限度缺氧微环境中的HIF-1α和HIF-2a表达上调[26]。在缺氧环境中，HIF-1a在GSC与非GSC和神经干细胞的上调的机制相同。然而，HIF-2a在GSC中的表达具有特殊性[25]。HIF-2a的表达与HGG患者的生存相关。值得注意的是，HIF-2a在常氧条件下由GSC表达，通过对临床HGG标本的组织病理学评估HIF-2a，揭示了GSC在血管和缺氧或坏死区域分布[25]。通过共定位CD133和HIF-2a阳性染色，发现在常氧条件下，HIF-2a在GSC表达[25]。在GSC中抑制HIF-1a不影响干细胞标志物的表达，但显著降低了神经球形成和VEGF表达[25]，对内皮细胞增殖具有下调作用。降低GSC中HIF-2a表达能显著减少干细胞标志物表达，相较于HIF-1a，除了能在更大程度上减少神经球形成和减少VEGF，而且其在下游对内皮细胞具有调节作用[25]。在非GSC中，敲低HIF-2a对VEGF的生成没有影响[25]。有趣的是，HIF-2a在非GSC中的过表达将非GSC重编码为GSC，强调了低氧微环境的重要性。在体内，敲低HIF能减弱肿瘤形成。总之，缺氧微环境是一种独特的微环境，通过靶向GSC能下调HIF-2a，干细胞标志物表达和VEGF信号传导所产生的下游效应。在缺氧微环境中，封锁VEGF可以下调其中一种效应机制。因此，缺氧微环境可能被认为是一个间接靶标。因此，针对缺氧微环境的治療主要靶点是HIF家族，主要是HIF-1a和HIF-2a分子。通过干涉HIF分子对缺氧微环境的作用，从而抑制缺氧对胶质瘤发生发展的促进作用[15]。

4 展望

GSCs亚群细胞自我更新，并对放疗和化疗具有抵抗性，使得其能持续存活，引起治疗后复发。GSCs与周围增生血管、缺氧周围坏死微环境相互作用，是其维持干细胞特性、抑制分化、增强自我更新以及放化疗抵抗性和致瘤性的机制。基于此，作用于GSCs的生存微环境联合常规手术、化疗和放射治疗可能为减少胶质瘤复发和改善患者生存提供了一种新的有前景的治疗方法。

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（收稿日期：2018-05-07 本文編辑：任 念）