常压室温等离子体（ＡＲＴＰ）诱变快速选育对亚洲玉米螟高毒的苏云金芽孢杆菌突变株

廖先清 周荣华 刘芳 张志刚 饶犇 陈伟 王开梅

摘要：采用常压室温等离子体（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变苏云金芽孢杆菌Bt-NBIC-380菌株，选育对亚洲玉米螟高毒力突变株。经过4轮的ARTP诱变、镜检及摇瓶发酵筛选得到的突变株Bt-NBIC-380-18-407，其摇瓶发酵液对玉米螟二龄幼虫效价达到6 835 IU/μL，杀虫晶体蛋白含量6.3 mg/mL。該突变株的效价较初始菌株提高了25.7%，杀虫晶体蛋白含量提高了18.9%。经过5次传代，证实该突变株具有良好的遗传稳定性。

关键词：常压室温等离子体（ARTP）诱变;苏云金芽孢杆菌Bt-NBIC-380;亚洲玉米螟;杀虫晶体蛋白;生物效价

中图分类号：S476.1         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）21-0123-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.032           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Rapid Mutation Breeding of Highly Toxic Bacillus thuringiensis Strain Against Asian Corn Borer-by Atmospheric and Room Temperature Plasma

LIAO Xian-qing，ZHOU Rong-hua，LIU Fang，ZHANG Zhi-gang，RAO Ben，CHEN Wei，WANG Kai-mei

（Hubei Biopesticide Engineering Research Center/Biopesticide Subcenter of Hubei Science and Technology Innovation Center，

Wuhan 430064，China）

Abstract： A highly toxic Bacillus thuringiensis strain NBIC-380 against Asian corn borer was treated by atmospheric and room temperature plasma for improving the toxicity of the resulting mutants. Through 4 rounds of ARTP mutation and screening by microscopic checking，shake-flask fermentation and bioassay，one mutant designated as Bt-NBIC-380-18-407 with significant improvement of production of insecticidal crystal protein and potency-was obtained. The potency of the fermentation broth of the mutant against Asian corn borer larvae was increased 25.7% to 6 835 IU/μl，while the concentration of insecticidal crystal protein in fermentation broth was increased 18.9% to 6.3 mg/mL. The mutant showed rather good genetic stability after 5 times of consecutive transferring and cultivation.

Key words： ARTP mutagenesis; Bacillus thuringiensis; Asian corn borer;insecticidal crystal proteins; potency

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种革兰氏阳性杆状细菌，形成芽孢的同时会产生具有杀虫活性的伴孢晶体，对多种害虫具有特异杀虫活性，具有高效、安全及特异性强等特点，已成为目前开发时间最长、产量最大、应用最广的生物杀虫剂[1]，广泛应用于各种农业、园艺、卫生害虫等的防治，取得了巨大的经济、生态和社会效益。自21世纪之后，中国的玉米种植面积就一直呈上升趋势，温室效应的出现、连茬种植、秸秆还田措施的推行、玉米密植技术的推广，大大增加了玉米螟等病虫害发生的可能性[2]。目前，防治玉米螟的主要方法是化学防治，但易产生抗药性，用药量逐年上升;而化学农药的残留，影响产品品质，尤其影响鲜食玉米的食品安全。苏云金芽孢杆菌作为一种广谱性强、杀虫速度快、毒力高的生防微生物，在玉米螟的生物防治中发挥着重要作用。黑龙江省自2011年起已实施玉米螟绿色防控工程，采用湖北康欣农用药业有限公司生产的玉米螟专用苏云金杆菌可湿性粉剂和油悬浮剂，采取飞机喷雾或自走式高杆喷雾车地面喷雾大面积防治，取得了很好的防效。对玉米螟高毒力的苏云金芽孢杆菌的分离、选育是玉米螟绿色防控效果的关键因子。

诱变育种技术仍然是现在世界各国广泛使用的菌株选育技术，传统的诱变育种方法如紫外线辐照（UV）、亚硝基胍（NTG）、Co60γ射线辐照等方法都颇有成效[3]，但UV能量较大，会杀死细胞，极易对人体造成巨大伤害;NTG有毒，有致癌的可能性;电离辐射有一定的局限性，操作要求高且有一定的危险性，因此传统的诱变方法对试验操作者的人身安全有很大的潜在危险。由清华大学自主研发的新型常压室温等离子体（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）诱变技术是新兴的一种诱变技术，因其具有基因损伤强度高、突变范围广、处理条件温和、安全无辐射、操作便捷等优点[4]，已广泛应用于工业发酵高产菌株。本研究以实验室筛选保存的对玉米螟有特异性、高毒力的苏云金芽孢杆菌Bt-NBIC-380菌株为出发菌株，通过ARTP诱变育种，筛选获得一株遗传性能稳定、对玉米螟毒力得到明显提高的突变菌株，其发酵液生物效价和杀虫晶体蛋白含量均有所提高，为玉米螟绿色防控工程提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  菌株  苏云金芽孢杆菌Bt-NBIC-380菌株，湖北省生物农药工程研究中心从土壤中分离筛选。

1.1.2  供试虫  玉米螟采自黑龙江省，由湖北省生物农药工程研究中心养虫室保种并培养，提供供試二龄幼虫。

1.1.3  培养基  牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂20 g/L，pH调至6.8～7.2。发酵培养基，玉米淀粉30 g/L、酵母浸粉   5 g/L、蛋白胨5 g/L、MgS04·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 1 g/L、花生饼粉20 g/L、鱼粉10 g/L，pH调至7.5。培养基灭菌温度为121 ℃，时间为30 min。

1.1.4  试剂与仪器  常压室温等离子体诱变机（无锡源清天木生物科技有限公司）;恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）;摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）;721可见分光光度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）;超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）;显微镜（日本Olympus公司）。

1.2  菌株的ARTP诱变

1.2.1  芽孢悬浮液的制备  将保藏于砂土管的苏云金芽孢杆菌Bt-NBIC-380菌种直接转接于牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上进行复壮，置于30 ℃恒温培养箱中培养4 d，挑起一环菌苔转接于牛肉膏蛋白胨液体摇瓶中（100 mL/500 mL三角瓶），220 r/min，30 ℃振荡培养至芽孢全部形成。离心收集芽孢，然后无菌水稀释，制备一定浓度的芽孢悬液，OD600 nm在0.3～0.5，作为诱变母液。

1.2.2  菌株的ARTP诱变  在超净工作台中用移液枪移取10 μL的诱变母液，均匀涂抹在直径为6 mm的无菌金属垫片上，将其置于无菌平皿内移至提前开机预热20 min的ARTP诱变机中，电源功率为100 W，处理距离2 mm，工作气流量10 slpm，以氦气为工作气体，以处理时间为诱变的主要操作参数，诱变时间设置为20、40、60、80、100、120 s。诱变处理完成以后取出金属垫片放入装有1 mL无菌水的EP管中，涡旋振荡1 min。取经振荡的菌液稀释至适当浓度涂平板，放入30 ℃恒温培养箱中培养2 d。经上述条件培养后，计数各平板上单菌落个数，取3次平均值，绘制出致死率曲线。

1.2.3  ARTP诱变致死率的计算  ARTP诱变致死率的计算参照以下公式：

致死率=（A-B）/A×100%

式中，A为诱变处理前芽孢悬液的活芽孢浓度;B为诱变处理后芽孢悬液中活芽孢浓度。

1.3  诱变菌株的筛选

1.3.2  摇瓶筛选  将斜面镜检确定的芽孢形成率高、营养体少、晶体比例高、晶体整齐的突变株接种于摇瓶发酵培养基中（500 mL三角瓶每瓶装量50 mL），30 ℃，220 r/min振荡培养30 h，涂片染色后镜检。

1.3.3  发酵液生物效价测定和杀虫晶体蛋白质含量测定  挑取摇瓶发酵镜检确定的芽孢形成率高于90%、菌体整齐、生长速度快、晶体大小整齐的突变株发酵液进行生物效价测定和杀虫晶体蛋白含量测定。

1.3.4  砂土管保存  挑取发酵液生物效价和杀虫晶体蛋白含量均高于出发菌株10%以上的菌株，刮下芽孢放入已灭菌并经无菌检查的砂土管中，用接种环打散混匀，置于干燥器中保存。

1.4  生物活性测定和杀虫晶体蛋白含量测定

1.4.1  对玉米螟生物活性测定  生物活性测定采用混菌法，参照国家标准GB/T 19567.1-2004中棉铃虫生物测定方法进行[5];将发酵液稀释至一定浓度，每样品设3个浓度，取适量与饲料混合均匀，倒入24孔板，晾干后接玉米螟二龄幼虫，设空白对照和标准品对照，封严24孔板，于25 ℃培养72 h，检查各处理死亡及存活虫数，并计算发酵液生物效价[6]。

1.4.2  杀虫晶体蛋白含量测定  参照国家标准GB/T 19567.1-2004中苏云金杆菌杀虫晶体蛋白含量测定方法进行[5]。

1.5  数据处理及分析方法

生物测定数据采用SPSS软件进行分析，计算LC50和95%置信区间[7]。

1.6  突变株遗传稳定性分析

在斜面培养基上活化筛选得到高毒力的菌株，培养96 h，连续在斜面上转接5次进行摇瓶发酵，分别进行显微镜检芽孢形成率、生物活性测定、杀虫晶体蛋白含量测定，比较突变株毒力的稳定性。

2  结果与分析

2.1  ARTP诱变时间的选择

不同诱变时间下苏云金芽孢杆菌Bt-NBIC-380菌株芽孢悬液ARTP处理的致死率曲线如图1所示。从图1中看出，随着处理时间的增加，菌体的存活率逐渐降低。40 s以后，致死率大幅度上升，这说明苏云金芽孢杆菌Bt-NBIC-380菌株对ARTP较敏感，产生的致突变能力较大，处理60 s后致死率在90%左右，但当作用时间达到80 s时，ARTP的诱变作用较为剧烈，致死率达到95.6%。当处理时间100 s时，致死率接近100%。综合考虑菌株致死率、菌株的生物活性，为提高获得生产能力和生存能力较强菌株的概率，故选定致死率到达80%～90%左右作为诱变依据[8，9]，本研究中选定ARTP处理时间为60 s，此时致死率为89.3%。

2.2  高产突变株的筛选

2.2.1  斜面初筛  将ARTP诱变时间60 s并经5次单菌落分离得到的749株斜面进行涂片镜检，斜面镜检芽孢形成率高、营养体少、晶体率高、晶体整齐的菌株，共得到76株优势菌株进行下一轮摇瓶发酵。5次镜检初篩优势菌株比例在10%左右，镜检情况如表1所示。

2.2.2  摇瓶筛选  将斜面镜检初筛得到的76株优势菌株进行摇瓶发酵，并设出发菌株作对照。30 h分别涂片镜检，得到15株发酵芽孢形成率高于95%，菌体整齐，对晶体大、形态好的突变株分别进行生物活性测定和杀虫晶体蛋白含量测定，3次重复取平均值，结果如表2所示。采用生物效价和晶体蛋白双指标进行高毒力突变菌株的判定，生物效价和晶体蛋白含量均高于出发菌株20%的菌株有7株，分别是NBIC-380-401、NBIC-380-402、NBIC-380-406、NBIC-380-407、NBIC-380-410、NBIC-380-411、NBIC-380-415。

2.3  高毒力突变株的摇瓶复筛

将摇瓶筛选得到的7株高毒力突变株进行摇瓶发酵，并设出发菌株作对照。30 h分别涂片显微镜检，进行生物活性和杀虫晶体蛋白含量测定，3次重复取平均值，结果如表3所示。综合摇瓶发酵芽孢形成率、发酵周期、生物效价和晶体蛋白含量，NBIC-380-402、NBIC-380-407两菌株各种指标均优于其他菌株，其中NBIC-380-407菌株效价较出发菌株提高25.7%，晶体蛋白含量提高18.9%，发酵性能优良。

2.4  突变高毒力菌株的遗传稳定性

为了检测突变株的遗传稳定性，对突变高产株NBIC-380-18-407在试管斜面上连续转接5代，显微镜检，然后进行摇瓶发酵培养，检测发酵液的生物效价和杀虫晶体蛋白含量，结果（表4）表明，随着传代次数的增加，菌株的晶体形态、芽孢形成率、发酵液的杀虫活性及杀虫晶体含量等各项指标无明显变化，至第5次传代后也较为稳定。这说明通过ARTP诱变所获得的突变株NBIC-380-18-407具有良好的遗传稳定性，可作为工业生产菌株。

3  讨论

化肥农药减施增效是关系到中国农产品品质和食品安全的战略性问题。通过传统菌种选育、诱变育种及现代分子技术手段，建立高效快速的高活性菌株选育方法与手段，筛选获得高活性或高生态适应性的菌株，创制安全高效的生物杀虫剂，有助于改变中国食品安全现状，具有广阔的发展前景，其社会效益和经济效益是显而易见的。诱变育种是工业化生产中选育高活性菌株的重要有效手段。相对于其他传统诱变技术，ARTP诱变育种具有操作简便、设备简单、条件温和、安全性高、一次操作可获得大量的突变体等优异性能，达到高效育种的目的。本研究利用ARTP对玉米螟高毒力菌株苏云金芽孢杆菌NBIC-380进行诱变，通过斜面镜检初筛、摇瓶三轮复筛，获得发酵效价6 835 IU/μL晶体蛋白含量6.3 mg/mL，并且遗传稳定的突变菌株NBIC-380-18-407，建立了一套高效的筛选方法，为芽孢杆菌的菌种选育提供了参考方法。突变株发酵水平较初始菌株提高20%以上，提升了产品质量，在工业化大规模生产中可显著降低生产成本。

参考文献：

[1] 赵  宇，刘宏伟，路  杨，等.一株对玉米螟高毒力的苏云金芽孢杆菌的鉴定及其杀虫活性[J].玉米科学，2017，25（6）：148-152.

[2] 胡金宏，杨树林.浅谈玉米病虫害的综合防治技术要点[J].农业与技术，2016，36（12）：114-115.

[3] 田淑翠，牛延宁，常忠义，等.常压室温等离子体诱变茂源链霉菌菌株[J].中国生物工程杂志，2016，36（9）：47-53.

[4] 王耀耀，朱研研，付美红，等.那他霉素产生菌的ARTP的诱变育种及发酵工艺优化[J].中国医药工业杂志，2016，47（8）：999-1004.

[5] GB/T 19567.1-2004苏云金芽胞杆菌原粉[S].

[6] 周荣华，廖先清，刘  芳，等.玉米螟高毒力生防菌株筛选与发酵工艺研究[J].湖北农业科学，2015，54（24）：6248-6251.

[7] 贾春生.利用SPSS软件计算杀虫剂的LC50[J].昆虫知识，2006， 43（3）：414-417.

[8] 马娜娜，马韵升，张心青，等.一株产胶霉菌素菌株的ARTP诱变及筛选[J].中国农学通报，2017，33（29）：36-41.

[9] 杜丹清，王  刚，庹有朋，等.γ-聚谷氨酸生产菌种的ARTP诱变及其发酵条件优化[J].食品与发酵科技，2017，53（6）：5-10.