速冻芦笋的电子束检疫杀菌和辐照工艺

王海宏 ， 陈志军 ， 颜伟强 ， 孔秋莲 *， 岳 玲 ， 戚文元 ， 孙御风

（1.上海市农业科学院作物育种栽培研究所，上海 201403；2.上海束能辐照技术有限公司，上海 201403）

石刁柏（Asparagus officnalis Linne）俗称芦笋，属于百合科天门冬属，为多年生宿根作物，其味道鲜美，脆嫩爽口，具有丰富的营养价值和药用价值[1]。目前，中国已成为世界上芦笋种植面积最大的生产和出口国，是我国重要的出口创汇农产品。主要以芦笋罐头、速冻芦笋产品销往日本、韩国、欧美以及东南亚等国家和地区[2]。速冻蔬菜解决了蔬菜的长期贮藏保鲜问题，不仅在美国、日本、瑞典等发达国家发展特别迅速，在我国北方地区尤其是东北地区也出现大量需求，许多大中城市甚至县城都在积极发展速冻蔬菜。

然而，近年来速冻食品安全事件却不断发生，速冻食品常遇“细菌门”，2012年速冻食品龙头企业思念、湾仔码头、三全水饺先后被检出金黄色葡萄球菌。造成速冻食品不合格的主要原因是微生物超标的问题。速冻蔬菜在加工过程中即可清除大部分附着的微生物和寄生虫卵，细菌主要来源于加工中的设备、容器、加工人员等的污染[3]，一旦发生细菌污染现象，不仅经济受到损失，还会带来无法预计的食品安全隐患。

辐照是一种国际公认的、理想的冷杀菌技术，在世界范围内用于食品保存、延长保质期和控制通过食品传播的病原体。有关γ射线和电子束食品杀菌方面的报道比较多[4-11]，尤其是对肉制品杀菌保鲜中的应用研究[12-16]，在速冻蔬菜产品中鲜见报道。高能电子束辐照因其剂量率高，加工速度极快，产品一般从进辐照室到出来大约几分钟，非常适合速冻食品的辐照，而且剂量均匀，穿透深度可控，可满足一些特殊辐照工艺的要求。作者以出口速冻芦笋为试验材料，研究电子束辐照检疫杀菌及加工工艺，为解决产销与贮运过程中的微生物二次污染问题，保障速冻蔬菜产品的食用安全提供有力的技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料

速冻芦笋条：产地山东莒县，品种为UC800，夏笋，规格 M 级，聚乙烯（PE）包装，1.0 kg/袋，购于山东莒县恒盛食品有限公司。

金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）和出血性大肠杆菌 O157：H7（ATCC43895），购于上海慧耘生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化培养 甘油冻存的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，无菌条件下，用接种环挑取第一代菌种于营养琼脂斜面上，划线培养24 h（35～37℃），斜面即为第二代菌株，挑取单一菌落，依次于营养琼脂斜面上划线培养，斜面即为第三代菌株。挑取第三代菌株纯菌落转入TSB培养基中，35～37℃增菌培养24 h后，得到标准菌株的菌悬液，待用。

1.2.2 样品处理 速冻芦笋条，在无菌条件下，取25 g分装于BagLight无菌平底均质袋内，辐照后立即测定菌落总数、大肠菌群和霉菌酵母数量。速冻芦笋条经6 kGy辐照灭菌后，分装于BagLight无菌平底均质袋内，分别接种金黄色葡萄球菌（ATCC6538） 和 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 O157：H7（ATCC43895）菌悬液，于辐照后立即检测致病菌数量。

1.2.3 辐照处理 样品在上海束能辐照技术有限公司进行电子束辐照处理，IS1020型电子直线加速器，额定能量10 MeV，功率20 kW。

试验设置对照0 kGy，电子束辐照处理0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、4.0、8.0 kGy，采用重铬酸钾（银）化学剂量计检测实际剂量。每个剂量处理设3个重复，微生物学检验于辐照处理后立即检测存活菌数量。品质测定样品于辐照处理后，-18℃下贮存30 d进行相关指标的分析测定。

1.3 辐照工艺

辐照工艺1：两袋产品上下叠加平放（厚度10.6 cm），单面辐照；

辐照工艺2：两袋产品上下叠加平放（厚度10.6 cm），双面辐照；

辐照工艺3：两袋产品之间添加分装产品上下叠加平放（厚度14.2 cm），双面辐照；

辐照工艺4：三袋产品上下叠加平放（厚度16.0cm），双面辐照。

1.4 产品穿透深度剂量分布

1.4.1 辐照工艺1 剂量分布见图1。剂量计为CTA薄膜剂量片，按其编号及示意图布于产品上。

图1 CTA薄膜剂量计分布示意图Fig.1 Distribution map of CTA Film dosimeter

1.4.2 辐照工艺2 剂量分布见图1。剂量计为CTA薄膜剂量片，按其编号及示意图布于产品上。

1.4.3 辐照工艺3 剂量分布见图2。剂量计为CTA薄膜剂量片，按其编号及示意图布于产品上。

图2 CTA薄膜剂量计分布示意图Fig.2 Distribution map of CTA Film dosimeter

1.4.4 辐照工艺4 剂量分布同图2。剂量计为CTA薄膜剂量片，按其编号及示意图布于产品上。

1.5 测定方法

1.5.1 微生物检验 菌落总数、霉菌和酵母菌、大肠菌群、致病菌（金黄色葡萄球菌、出血性大肠杆菌）的 测 定 依 据 GB4789.2-2010[17]、GB4789.15-2010[18]、GB4789.3-2010[19]、GB4789.10-2010[20]和GB4789.38-2012[21]，于辐照后立即进行测定。

1.5.2 D10值计算 D10值是指被辐照物微生物总数降低到原始值10%时所需要的辐照剂量，它反映了被辐照物中的微生物抗辐射能力的大小。计算公式为：SD=D×lgN0/N 式中，SD 为辐照剂量（kGy），D为目标菌 D10值（kGy），N0为辐照前污染菌数（CFU/g），N为辐照后残留菌数 （CFU/g），lg为以 10为底对数值[22]。

1.5.3 感官指标 不同剂量辐照处理后于-18℃下放置30 d，参照进出口速冻蔬菜检验规程SN/T 0626-2010的要求[23]，从色泽、形态质地和风味等方面对速冻芦笋进行感官评价。

1.5.4 叶绿素质量分数测定 参照蒋德安等[24]的方法略有改动。均匀取样于芦笋的顶端鳞片和茎中部，剪碎混匀。称取剪碎的样品1 g，共3份，分别放入研钵中，80%丙酮提取，滤纸过滤，棕色容量瓶定容至50 mL，提取液在波长663、645 nm下测定吸光度值，计算公式：

叶 绿素质量分数 （mg/100 g）=（20.2×OD645+8.02×OD663） ×50/10

1.5.5 可溶性糖质量分数测定 参照高俊凤的方法进行测定[25]。

1.5.6 维生素C质量分数测定 钼蓝比色法进行测定[26]。

1.5.7 数据分析 每个试验重复3次，采用Excel 2010和SPSS 13.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 辐照对速冻芦笋微生物数量的影响

2.1.1 速冻芦笋中微生物数量的变化 速冻芦笋经辐照后立即检测菌落总数、霉菌总数和大肠菌群，结果见表1。对照和处理大肠菌群均未检出。从表1中可以看出，辐照剂量2.0 kGy以上时，样品的菌落总数、霉菌总数明显低于对照。随着剂量的升高，电子束对微生物的杀灭作用增大，存活菌的数量不断降低，辐照剂量为4.0 kGy时，速冻芦笋产品中菌落总数及霉菌均未检出。

表1 速冻芦笋辐照后微生物的数量Table 1 Number of microorganisms after frozen asparagus irradiation

2.1.2 对食源性致病菌的杀菌效果研究 对金黄色葡萄球菌 （ATCC6538）和肠出血性大肠杆菌O157：H7（ATCC43895）标准菌株进行培养，制备标准菌悬液，经电子束辐照后立即检测菌悬液存活菌的数量，结果见表2。随辐照剂量的升高，存活菌数量不断降低，剂量为2.0 kGy时，肠出血性大肠杆菌O157：H7未检出，剂量为2.5 kGy时，金黄色葡萄球菌未检出。

表2 菌悬液辐照后存活菌的数量Table 2 Number of surviving bacteria after bacterial suspension irradiation

D10值是杀灭90%的微生物所需剂量，是选择合适杀菌剂量的重要参数。金黄色葡萄球菌（ATCC6538） 和 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 O157：H7（ATCC43895）标准菌悬液，辐照后存活菌总数的对数值与吸收剂量的关系见图3-4。存活菌数量的对数与吸收剂量之间呈显著的线性负相关，通过数据线性回归分析，得到回归方程分别为y=-3.024 3x+8.091 7和y=-4.536 2x+9.391 5，由回归方程的斜率K（K=1/D10）计算出 D10值分别为 0.33 kGy和 0.22 kGy。

取标准菌悬液，分别添加至速冻芦笋 （经6.0 kGy辐照处理的）样品中，辐照后立即检测样品中存活菌数量，结果见表3。2.5 kGy电子束辐照可以完全杀灭样品中的金黄色葡萄球菌和肠出血性大肠杆菌。

图3 金黄色葡萄球菌存活菌对数与吸收剂量的关系Fig.3 Survival aerobic bacterial counts in Staphylococcus aureus irradiated by E-beams with different doses

图4 肠出血性大肠杆菌存活菌对数与吸收剂量的关系Fig.4 Survival aerobic bacterial counts in Enterohemorrhage E．Coli irradiated by E-beams with different doses

表3 接种菌悬液的芦笋辐照后存活菌的数量Table3 Numberofsurviving bacteria among the asparagus inoculated with bacterial suspension after irradiation

添加了金黄色葡萄球菌（ATCC6538）和肠出血性大肠杆菌 O157：H7（ATCC43895）的速冻芦笋样品，辐照后样品中存活菌总数的对数值与吸收剂量的关系见图5-6。存活菌数量的对数与吸收剂量之间呈显著的线性负相关，由线性回归分析得出回归方程y=-2.826 6x+6.923 2和y=-4.005 6x+8.445 6，由回归方程的斜率 K（K=1/D10）计算出 D10值分别为0.35 kGy和 0.25 kGy。

2.2 辐照对速冻芦笋品质的影响

2.2.1 感官指标的变化 表4可以看出，辐照后贮存30 d时，对照组、4.0 kGy及4.0 kGy以下辐照组仍保持固有的颜色、光泽，质地良好、形态完整，气味正常。样品自然解冻后称约250 g，放入盛有沸水的煮锅中，加热3 min，开盖后检验均无异味。仅8.0 kGy辐照组颜色稍浅，气味淡，并无异味。

图5 接种金黄色葡萄球菌的芦笋中存活菌对数与吸收剂量的关系Fig.5 Survival aerobic bacterial counts inasparagus inoculated withStaphylococcus aureus irradiated by E-beams with different doses

图6 接种肠出血性大肠杆菌的芦笋中存活菌对数与吸收剂量的关系Fig.6 Survival aerobic bacterial counts inasparagus inoculated with Enterohemorrhage E．Coli irradiated by E-beams with different doses

2.2.2 叶绿素、可溶性糖、维生素C质量分数的变化 速冻芦笋经不同剂量的电子束辐照处理后，-18℃下贮存30 d时，取样检测其叶绿素、可溶性糖和维生素C质量分数，结果见表5。叶绿素、可溶性糖和维生素C质量分数变化随辐照剂量的升高呈降低趋势，辐照剂量≤2.0 kGy时，处理与对照之间均无显著性差异，当辐照剂量为8.0 kGy时，电子束辐照处理显著影响其营养品质，叶绿素、可溶性糖和维生素C质量分数分别比对照降低了22.5%、20.9%和35.3%。维生素C质量分数对电子束辐照较为敏感，4.0 kGy时，比对照降低了25.1%。

表4 辐照对速冻芦笋感官指标的影响Table 4 Effect sensory indicatorsof frozen asparaguson E-beams irradiation

表5 辐照对速冻芦笋品质指标的影响Table 5 Effect sensory indicators of frozen asparaguson E-beams irradiation

2.3 不同辐照工艺下的剂量分布及辐照工艺确定

表6-9列出了不同辐照工艺下速冻芦笋不同位点的剂量值。由表6看出，两袋产品上下叠加（厚度10.6 cm），3次重复试验，单面辐照的最低剂量点分别为0.41、0.40、0.46 kGy，对应的最高剂量点分别为 5.88、5.95、6.20 kGy， 剂量不均匀度分别为14.34 （5.88/0.41）、14.89 （5.95/0.40） 和 13.48 （6.20/0.46）。

两袋产品上下叠加（厚度10.6 cm），双面辐照的最低剂量点分别为6.20、6.08、6.26 kGy，最高剂量点分别为8.90、8.82、8.98 kGy，剂量不均匀度分别为 1.44（8.90/6.20）、1.45（8.82/6.08）和 1.43（8.98/6.26）。

两袋之间增加分装产品上下叠加平放 （厚度14.2 cm），双面辐照的最低剂量点分别为5.39、5.96和 5.57 kGy， 最高剂量点分别为 6.13、6.91、6.35 kGy， 剂量不均匀度分别为 1.14（6.13/5.39）、1.16（6.91/5.96）和 1.14（6.35/5.57）。

三袋产品上下叠加（厚度16.0 cm），双面辐照的最低剂量点分别为4.53、4.41、4.74 kGy，最高剂量点分别为5.56、5.39、5.77 kGy，剂量不均匀度为1.23（5.56/4.53）、1.22（5.39/4.41）和 1.22（5.77/4.74）。

表6 辐照工艺1的剂量分布Table 6 Dose distribution of irradiation technology 1

表7 辐照工艺2的剂量分布Table 7 Dose distribution of irradiation technology 2

表8 辐照工艺3的剂量分布Table 8 Dose distribution of irradiation technology 3

表9 辐照工艺4的剂量分布Table 9 Dose distribution of irradiation technology 4

根据试验结果，剂量不均匀度以产品上下叠加平放，双面辐照处理较低，由此确定了速冻芦笋产品双面辐照的处理工艺。适宜的辐照深度为14.2 cm，辐照不均匀度控制在1.20以内，符合产品生产要求。实际生产中产品加工数量依据辐照加工托盘宽度而定。

3 讨论

速冻芦笋在生产、加工和贮运环节中，受到微生物污染的几率较大，特别是食源性致病微生物，极易造成安全隐患，通过高能电子束辐照检疫冷杀菌技术能够解决速冻芦笋生产与流通环节中的病原微生物污染问题。

1）试验研究表明，标准菌悬液中金黄色葡萄球菌和出血性大肠杆菌在高能电子束辐照下的D10值分别为0.33 kGy和0.22 kGy；速冻芦笋中金黄色葡萄球菌和出血性大肠杆菌的D10值分别为0.35 kGy和0.25 kGy，说明两种致病菌对高能电子束辐照的耐受性弱。

大多数致病细菌对辐照表现较为敏感，在降低鲜切蔬菜致病菌方面，鲜切圆生菜、苦瓜、彩椒中肠炎沙门氏菌的 D10值分别为 0.24、0.22、0.22 kGy，英诺克李斯特菌的 D10值分别为 0.22、0.20、0.21 kGy[27]。鲜切青椒大肠杆菌O157：H7的D10值为0.31 kGy[28]。在降低禽肉制品和水产品致病菌方面，辐照能有效杀灭酱排骨中大肠杆菌，其D10值分别为0.252～0.500 kGy[29]；Song等[30]利用电子束辐照接种了单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌3种食源性致病菌并且经腌制、发酵过的杂色蛤，其辐照灭菌剂量D10值分别为0.79、0.81、0.36 kGy，本研究结果与之相似。

2）从不同剂量电子束辐照对速冻芦笋感官及品质的影响中分析得到，辐照剂量≤4.0 kGy，速冻芦笋辐照后-18℃下贮存30 d时，可溶性糖、叶绿素质量分数与对照相比，均无显著性差异，色泽、形态质地、风味均未发生明显变化。辐照剂量4.0 kGy时，速冻芦笋产品中菌落总数、霉菌、大肠菌群均未检出。产品通过外源添加致病菌菌悬液后，初始带菌量为107～108数量级时，2.5 kGy辐照剂量能完全杀灭产品中的致病菌。

目前，涉及速冻蔬菜辐照保鲜杀菌的研究鲜见报道，电子束辐照杀菌保鲜在新鲜果蔬上的应用研究较多，如花椰菜、鲜切西洋芹、葡萄、蓝莓、芒果、阳桃等果蔬辐照保鲜的研究[31-35]。低剂量辐照可以延迟果蔬衰老进程，有效控制病原微生物数量，货架贮藏期间维持良好的营养品质[36-37]。速冻蔬菜与新鲜果蔬比较而言，对电子束辐照的耐受性强。本试验研究结果表明，4.0 kGy电子束辐照处理速冻芦笋，对其感官及营养品质没有明显影响，并能有效地控制产品中的致病菌。

食品中的水分对辐射很敏感，水接受辐射后可形成离子、水合电子、羟自由基等，最终形成氢和过氧化氢等[38]，这些产物可与食品中的其它成分（糖类、蛋白质、维生素等）发生反应，称“辐照效应”或“间接作用”。新鲜果蔬产品中含水量丰富 （大于90%水分），多为自由水，水分活度大，辐照效应显著；而通过冰冻而固定水分的食品，由于缺少“自由”水分都不会显著产生这种“间接”的生物学效应。因此，与新鲜果蔬比较，速冻食品相对来说更耐辐照。

3）依据上海束能辐照技术有限公司受控工作文件，密度为1.00 g/cm3的产品不同深度单双面辐照剂量的关系，可确定不同密度产品的辐照深度，其最大辐照深度H=（1/p）×9.60。密度为0.90 g/cm3的速冻芦笋，理论上最大辐照深度为10.67 cm厚度包装的产品，实际上采用单面辐照，电子束能穿透单个包装的产品，辐照两个包装产品时，下表面吸收剂量仅为入射剂量的7%左右。单个包装产品单面辐照，表面入射剂量与最小点剂量的比值为1.33、1.36、1.37，平均值为 1.35，产品的深度剂量不均匀度高。综合考虑辐照不均匀度和加工效率，速冻芦笋产品采用双面辐照的处理工艺，适宜的辐照深度为14.2 cm，辐照不均匀度为1.15，可以满足生产要求。采用双面辐照，3袋产品（辐照深度为16.0 cm）中剂量最低值在中部位置，虽然产品的辐照不均匀度在1.22左右，但是质量存在安全风险，必须增加入射剂量才能满足生产要求，生产加工成本相应增加。

4 结语

由上述试验结果可以得出，金黄色葡萄球菌、出血性大肠杆菌对高能电子束辐照耐受性弱，辐照剂量2.5 kGy时，可以完全杀灭速冻芦笋样品中的致病微生物。产品经4.0 kGy辐照剂量处理后，菌落、霉菌和大肠菌群均未检出，可溶性糖、叶绿素质量分数、色泽、形态质地、风味与对照相比，均未发生明显变化，仅维生素C质量分数下降稍快。速冻绿芦笋采用双面辐照，辐照适宜深度为14.2 cm，不均匀度1.15，可以满足生产要求。

因此，建议速冻芦笋产品采用4.0 kGy以下剂量辐照，辐照工艺为双面辐照，可以有效控制食源性致病菌，保障产品食用安全性。本研究对于出口速冻蔬菜电子束辐照检疫及杀菌处理技术的应用具有一定的指导意义。

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