MEGJ调节缺氧后血管平滑肌细胞低反应性的cAMP-PKA机制

徐 竞，杨光明，李 涛，刘良明

血管低反应性是严重创伤/休克等临床重症晚期的重要病理生理改变，是导致患者对血管活性物质的舒缩反应功能降低甚至丧失，即使积极复苏仍然无法维持血压，甚至复苏失败和患者死亡的重要原因[1]。

本实验室的前期研究发现，失血性休克晚期表达增高的血管生成素-2 (angiopoietin-2，Ang-2)对血管诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和血管舒缩功能的调节是导致血管低反应性发生的重要原因[2]。且实验室前期研究发现，血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)与血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)间的缝隙连接，即肌内皮缝隙连接(myoendothelial gap junction，MEGJ)，介导了缺氧大鼠VSMCs的iNOS的表达增高和低反应性的调节，连接蛋白43(connexin43，Cx43)是参与其中的缝隙连接子亚型调节分子，但MEGJ和Cx43通过何种机制介导Ang-2对缺氧VSMCs中iNOS高表达和血管低反应性的调节，目前仍不清楚。

因此，本实验采用大鼠VECs和VSMCs的双面共培养模型，观察抑制可能的CX43调节信号分子后VSMCs中iNOS表达和收缩反应性的变化，筛选出参与调节的信号分子PKA；然后观察抑制cAMP-PKA系统后，MEGJ中Cx43蛋白表达、MEGJ形成和通讯功能的变化，明确MEGJ和Cx43介导Ang2对缺氧VSMCs中iNOS高表达和血管低反应性调节的机制。

材料与方法

1 实验动物和试剂

清洁级SD大鼠(雌雄各半，体重200～230g)购买自第三军医大学第三附属医院实验动物中心。抗大鼠β-actin，Cx43，iNOS抗体，外源性重组Ang2，FITC-BSA，Sulforhodamine B，cAMP ELISA试剂盒，PKC抑制剂Stausoporine，PKA抑制剂H-89，PKG 抑制剂KT-5823，cAMP抑制剂Rp-8-Br-cAMP购自Sigma公司; 羊抗兔或抗小鼠IgG二抗购自Pierce公司。Tie2 siRNA购自Thermo Fisher Scientific公司。Src抑制剂SU6656 购自Merck公司。Influx Pinocytic细胞加载试剂购自Molecular Probes公司。FITC-标记的phalloidin 购自Invitrogen公司。PKA 活性检测试剂盒 购自Enzo Life Sciences。

2 VECs和VSMCs双面共培养系统建立，实验分组和缺氧处理

共培养模型：按照文献中的方法[3]建立VECs和VSMCs的双面共培养模型：首先原代分离和培养SD大鼠的VECs和VSMCs，再采用Transwell双面培养皿(Corning公司，膜孔径为0.4μm)，先在膜反面接种VSMCs，接种密度1×105细胞/培养皿，CO2孵箱中培养1d后将培养皿翻转，然后在膜正面接种VECs，接种密度2×105细胞/培养皿，最后将双面均接种好细胞的双面培养皿置于CO2孵箱中培养，培养3d达到细胞>90%融合，即可用于后续实验。

实验分组：取已接种VECs和VSMCs细胞并培养好的双面培养皿，随机分组，对照组无需任何药物和缺氧处理；Ang2+缺氧组加入外源性重组Ang2(200ng/mL)后再行缺氧；PKA/PKC，PKG，Src抑制剂+Ang2+缺氧组分别加入H-89 (10μmol/L)，Stausoporine (0.1μmol/L)，KT-5823 (1μmol/L)，SU6656 (2μmol/L)，再加入外源性重组Ang2(200ng/mL)，然后再缺氧处理；Tie2 SiRNA+Ang2+缺氧组经Tie2 siRNA(25nmol/L)转染后，加入外源性重组Ang2(200ng/mL)，然后再缺氧处理；cAMP/PKA抑制剂+Ang2+缺氧组分别加入Rp-8-Br-cAMP (100μmol/L)和H-89 (10μmol/L)，再加入外源性重组Ang2(200ng/mL)，然后再缺氧处理。

缺氧处理：取已加入药物处理好的双面培养皿，置入缺氧罐，反复充入缺氧气体(5%CO2和95%N2)和夹闭，充气时间15min，夹闭时间10min，经“充气-夹闭”5个循环后，夹闭4h，完成缺氧处理。

3 VSMCs收缩反应性测定

按照文献[2]，取缺氧等处理完成的双面培养皿，将每个样本设两个双面培养皿，一个为实验皿加去甲肾上腺素处理(Norepine-phrine,NE)，另一个为对照皿不加去甲肾上腺素处理。在双面培养皿的上腔液中加入FITC-BSA(10mg/mL)，然后在下腔液中加入NE或培养基 (实验皿中加入1×10-9mol/L的NE，对照皿中加入与NE等体积的培养基)。每间隔15min从下腔液中抽取等体积培养液，采用多功能酶标仪读出荧光值，计算累计荧光通透率，VSMCs的收缩反应性=累计荧光通透率(实验皿)-累计荧光通透率(对照皿)。

4 VSMCs、MEGJ蛋白提取和蛋白表达检测

取按实验分组完成缺氧等处理的双面培养皿，在细胞裂解液中刮取双面培养皿膜的下表面得到VSMCs的细胞成分，再将刮干净的膜切下来，剪成小碎片，置于细胞裂解液中，旋转震荡后得到MEGJ成分。最后将分别含有VSMCs和MEGJ成分的细胞裂解液在完成裂解30min后，4°C 12000×g离心15min即分别得到VSMCs、MEGJ的蛋白成分。蛋白表达检测采用常规Western blot方法，检测VSMCs中iNOS蛋白表达时采用β-actin做内参，检测MEGJ中Cx43蛋白表达时采用GAPDH做内参[4]。

5 MEGJ形成检测

根据文献采用phalloidin荧光观察MEGJ形成[4]：取按实验分组完成缺氧等处理的双面培养皿，先用PBS洗细胞一次，再用多聚甲醛在37°C固定30min，然后切取双面培养皿膜做冰冻切片(厚度10μm)，在0.25% Triton X-100 和1%BSA混合液中常规透膜并封闭30min，再用FITC-标记的phalloidin在37°C孵育30min，荧光显微镜成像，经膜孔的phalloidin显示MEGJ，用单位面积的像素密度(/mm2)进行定量。

6 MEGJ通讯功能检测

根据文献观察染料Sulforhodamine B的转运反应MEGJ通讯功能[3]：取按实验分组完成缺氧等处理的双面培养皿，先用Influx Pinocytic细胞加载试剂在VECs中加载荧光染料Sulforhodamine B，浓度1mg/mL，稳定10min后，切取分离培养皿膜，以Leica TCS-SP激光共聚焦显微镜沿Z轴进行XY平面层扫，扫描间隔0.13μm。用VECs侧和VSMCs侧XY平面的Sulforhodamine B荧光密度差值定量MEGJ通讯功能。

7 统计学分析

结 果

1 参与Ang2对VSMCs中iNOS表达和收缩反应性调节的信号分子

在双面共培养系统，与正常对照组比较，缺氧后VSMCs中iNOS表达显著增高(图1a,P=0.006)，而收缩反应性显著降低(图1b,P=0.005)，外源性Ang2可维持增高的iNOS表达和降低的收缩反应性。在双面共培养系统上腔(VECs面)分别给予PKA、PKC、PKG、Src抑制剂(H-89，Stausoporine，KT-5823，SU6656)后，再观察外源性Ang2+缺氧VSMCs中iNOS蛋白表达和VSMCs收缩功能的变化，发现与Ang2+缺氧组相比，PKA抑制剂H-89可显著削弱其iNOS表达增高(图1a)和收缩反应降低(图1b)(P值分别为0.008和0.005)，而其他抑制剂无显著作用。

a b

图1 参与Ang2对VSMCs中iNOS表达和收缩反应性调节的信号分子。加在VECs面的PKA抑制剂可降低外源性Ang2作用下缺氧后VSMCs的iNOS蛋白高表达(A，n=3)，改善VSMCs低反应性(B,n=4～5)。与正常对照相比:*P<0.05，与Ang2+缺氧组相比:#P<0.05

2 VECs中cAMP-PKA系统对MEGJ中Cx43蛋白表达、MEGJ形成和通讯功能的调节

与正常对照组比较，缺氧后VECs中cAMP浓度，以及PKA活性显著增高(P<0.05)。与Ang2+缺氧组相比，Tie2 SiRNA可削弱cAMP浓度和PKA活性的增高(P<0.05)。见图2。

图2 缺氧及Ang2处理后VECs中cAMP浓度和PKA活性的变化。与正常对照相比：*P<0.05，与Ang2+缺氧组相比：#P<0.05

在双面共培养系统，与正常对照组比较，缺氧后MEGJ中Cx43蛋白表达(图3a)、MEGJ形成(图3b)和通讯功能(图3c)均显著增高(P值分别为0.006、0.005和0.001)。在双面共培养系统的VECs面给予cAMP或PKA抑制剂，发现与Ang2+缺氧组相比，增高的MEGJ中Cx43蛋白表达(图3a)、MEGJ形成(图3b)和通讯功能(图3c)均可被显著抑制(P值分别为0.004和0.005、0.007和0.007、0.01和0.01)。

图3 VECs中cAMP-PKA系统对Cx43蛋白表达、MEGJ形成和通讯功能的调节。a.MEGJ中Cx43表达;b.MEGJ形成，C: MEGJ通讯功能。anta: 抑制剂。b.中标尺10μm;c.中标尺 250μm。与正常对照相比：*P<0.05，与Ang2+缺氧组相比：#P<0.05

讨 论

本实验室前期研究表明，MEGJ介导了缺氧大鼠VSMCs的iNOS表达增高和低反应性的调节，Cx43是参与其中的缝隙连接蛋白亚型。而失血性休克晚期，增高表达的Ang-2作用于VEC中的Tie2受体后，经何种初级信号级联调节MEGJ的相关Cx亚型目前尚无文献报道。

根据以往研究，多种蛋白激酶分子通过调节Cx蛋白的表达和磷酸化水平改变其通讯功能，例如PKA、PKC、PKG、Src[5-6]。因此笔者采用了这些激酶的抑制剂，观察对外源性Ang2+缺氧大鼠VSMCs的iNOS表达和收缩反应的影响，结果发现PKA抑制剂可以降低其VSMCs的iNOS高表达和VSMC低反应性，而且缺氧后，VECs中cAMP浓度和PKA活性显著增高，外源性Ang2可维持其增高，而Tie2 SiRNA可削弱其增高。在双面共培养系统的VECs面给予cAMP或PKA抑制剂，均可显著抑制Ang2+缺氧组的MEGJ中Cx43表达增高、MEGJ形成增多和通讯功能增强。提示缺氧后上调的Ang2可能通过cAMP-PKA系统增高MEGJ的Cx43蛋白表达，从而促进MEGJ形成和通讯功能。以往文献也报道，在大鼠提睾肌动脉，PKA可促进VSMCs和VECs间的通道物质转运[7]，可促进Cx43转移至质膜和促进GJ聚集[8]，cAMP水平增高可以增强Cx43组成通道对染料的通透[9]，这些均与笔者的实验结果一致。

因此笔者研究发现，在失血性休克晚期，Ang-2经Tie2受体在VEC中诱导cAMP-PKA系统的表达上调，通过增强MEGJ的Cx43表达，开放通道促进细胞间通讯，从而调节VSMC中的iNOS表达和血管舒缩功能，导致血管低反应性。

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