驴人工授精技术的研究进展

郝志明，景兆国，沈鸿武

（1.天津农学院动科系，天津 300384；2.甘肃龙麒生物科技股份有限公司，瓜州 736100）

由于牛和猪等动物人工授精技术的发展和广泛应用，使得人们认为驴的人工授精技术也很成熟，但事实上驴的人工授精的受胎率并不高，鲜精的情期受胎率多在30%～50%之间，冻精的受胎率则更低（0～36%）。2006年，Oliveira等［1］通过冷冻剂对驴精液影响的研究发现，同样的驴冻精，给驴人工授精的受胎率为0%（0/53），而在马上则为40%（4/10）。即使在理论上，如卵子维持受精能力的时间也不确定，有的说驴与马一样，有的则认为更短。因此，有关驴人工授精技术还有很多方面需要深入研究解决，也需要对已有的研究成果进行总结，以期指导未来的研究方向和生产实践。

1 精液稀释液对受胎率的影响

在驴的人工授精过程中，若用原精液，其受胎率并不逊于马，但原精若用稀释液进行稀释，其受胎率一般仅在40%左右，远不如马的受胎率。为了克服精液稀释液的影响，几十年来人们进行过很多研究，但进展与人们的期望值还有不小的距离。

1.1 基础稀释液

Rossi等［2］分别用脱脂奶粉-葡萄糖稀释液和卵黄-甘氨酸稀释液作为基础稀释液，将稀释后的驴新鲜精液输入母马子宫，结果显示，脱脂奶粉-葡萄糖稀释液组母马的受胎率为64.52%，卵黄-甘氨酸稀释液组为61.11%。Carvalho等［3］用低温保存的中段驴精液给母马进行人工授精，受精母马的情期受胎率脱脂奶粉-葡萄糖稀释液组为56.52%（13/23），乳糖-卵黄稀释液组仅4.76%（1/21）。说明脱脂奶粉-葡萄糖做驴精液基础稀释液的人工授精效果要明显好于乳糖-卵黄基础稀释液。Marianne等［4］将经超高温处理奶稀释，且在4℃保存不超过8 h的驴精液（有效精子200×106，10 mL）人工授精至发情母马和母驴，发现母马和母驴的情期受胎率均为45%，没有明显差异（P＞0.05）。同时，他们对驴精液进行了更为深入的研究，试验分别将3种不同方式［处理Ⅰ用35℃奶稀释精液；处理Ⅱ先用35℃奶稀释，然后离心去除上清液，再加入22℃奶重新悬浮精子，并将精液保存在4℃的环境中；处理Ⅲ与Ⅱ组类似，但稀释液为E1稀释液（INRA82=1/2超高温处理奶和1/2含有糖和盐的溶液）］处理的精液分别人工授精至试验母驴（有效精子 400×106，10 mL），Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的情期受胎率分别为86%、78%、63%，表明Ⅰ组和Ⅱ组的处理方式明显优于Ⅲ组。Oliveira等［5］用脱脂奶为基础的BotuSemen稀释液稀释驴新鲜精液，然后给马和驴进行人工授精，发现输入的有效精子为500×106（15 mL）时，情期受胎率在马和驴分别为 93%（14/15）和 40%（6/15）。张瑞涛等［6］用加有20%卵黄的Tris-柠檬酸-葡萄糖稀释液低温保存24～48h的驴精液（试验组）以及单纯用Tris-柠檬酸-葡萄糖稀释液稀释的新鲜精液（对照组）对母驴进行了输精试验，结果表明，试验组和对照组的受胎率分别为29.7%（27/91）和 35.2%（109/309）。何良军等［7］则用柠檬酸钠-葡萄糖稀释液稀释驴精液，并在低温保存至第2天，精子活力在0.7以上时才用于输精，结果在3月份输精2头，怀孕1头，6月份输精4头，怀孕3头。

1.2 卵黄

Jasko等［8］在以奶为基础的稀释液中添加4%、8%和16%的卵黄，发现能够提高去除精浆的马精子存活率和向前运动精子的活率。Bedford等［9］在以奶为基础的稀释液中添加4%的卵黄，发现有利于维持体外低温保存马精子的存活率；同时他们也发现，在以奶为基础的稀释液中添加卵黄后，马精子的受精能力出现了明显的下降，添加4%卵黄组的胚胎回收率为17%，而不添加组的则为50%。Jepsen等［10］研究发现，在冷冻稀释液中添加高浓度的卵黄对马人工授精的受胎率有负面影响，甘油作为防冻剂且冷冻稀释液中的卵黄浓度为20%时，马的受胎率为0%；当用乙二醇代替甘油，卵黄浓度仍然是20%时，马的受胎率则为6.3%；当卵黄浓度降为5%时，马的受胎率则会提高到46.5%，因此可以看出，低的受胎率不仅与甘油的应用有关，而且与卵黄的高浓度有关。Jepsen等［10］的另一项研究结果表明，β-环糊精能够中和卵黄的这种损害受胎率的作用，在冷冻稀释液中添加β-环糊精后可使马的受胎率提高到58.3%，由于β-环糊精能与脂类和胆固醇结合，因此认为卵黄中的胆固醇可能就是引起马受胎率下降的物质。Parks等［11］的研究结果表明，高胆固醇对精子细胞是有害的，它既可引起人精子和马精子的不育［12-13］，又可能会使精子去能，抑制顶体反应［14］。

1.3 精浆

在精液冷冻过程中，通常会离心去除精浆，然后再加入含有卵黄的抗冻稀释液进行冷冻保存，因此冷冻精液会缺乏精浆。Rota等［15］研究发现，在解冻后的驴精液中加入精浆能提高母驴的受胎率。至于精浆的作用，Miró等［16］研究发现，精浆能够降低因精液进入子宫引起的中性粒细胞性炎性反应。Oliveira等［5］则认为，精浆中的蛋白可能会与卵黄中的胆固醇结合，从而可中和胆固醇的不良作用。也有大量在马［17-20］和牛［21］中的研究结果表明，精浆能够抑制多形核中性粒细胞的趋化和吞噬以及溶血性补体的活性；精浆蛋白可去除牛精子质膜上的胆固醇，激发精子获能；精浆分泌蛋白3有利于雌性生殖道内精子的清除，对马的生殖能力有促进作用。然而与此不同的是，Parks等［11］的研究则认为，解冻后的精液中加入精浆并不能提高冷冻保存驴精液的受孕率。

2 输精时间对受胎率的影响

由于驴的情期持续时间长，排卵受个体、品种、年龄、营养水平、季节、气候条件等的影响较大，排卵多在夜间，以及排出卵子维持受精能力的时间很短，因此很难确定发情母驴的排卵时间和适配时间。传统的配种方法是在发情开始后的3～4 d开始，隔天本交一次，直至发情结束。这种方法费时费力，浪费种公驴的精液和精力，严重阻碍优良品种的推广应用。随着卵巢卵泡直肠检查技术的应用，输精时间的确定确实有了很大的改善，但这一技术很难掌握，需要很长时间实践经验的积累。近些年来，卵泡发育和排卵的B超检测技术的应用为这一问题的解决带来一些曙光。

Saragusty等［22］用驴的冷冻精液给20头发情母驴进行了人工授精，结果表明，母驴的总受胎率50%（10/20），其受胎率与卵泡的直径有密切关系，卵泡直径在33.1～37.4 mm时受胎率90%（9/10），卵泡直径小于33.1 mm时受胎率0%，卵泡直径大于37.4 mm时仅1头驴怀孕。冯玉龙等［23］也根据卵泡的检测情况对驴进行了人工授精试验，且在驴的发情期每12小时用B超检查1次卵泡，排卵前每2小时检查1次，试验组母驴在即将发生排卵时（大而不规则）进行人工授精；对照组则在卵泡发育到直径大于35 mm时进行人工授精，并在排卵后再授精1次。结果表明，试验组驴的情期受胎率85%（17/20），而对照组64.6%。

从现有的研究资料来看，多数人在监测卵泡发育情况时只注重卵泡的直径，对卵泡的形状、卵泡壁的薄厚和肿胀情况未给以足够的重视，造成卵泡发育检测对排卵和适配时间确定的指导意义不够理想。可以想象的是不管卵泡有多大，若要排卵，卵泡壁就会变薄变软，并因水肿而出现反光强度的下降，就会引起卵泡形状的改变，卵泡会变成椭圆形、卵圆形和梨形等，特别在直肠探头按压时。这里并不是说卵泡的直径大小不重要，而是就排卵的指导意义来讲，卵泡的形状和卵泡壁的状况可能更重要。

近年来，人们还对诱导排卵情况下人工授精的怀孕情况进行了探索。Rota等［15］在卵泡发育到直径为32 mm时，用2 000 IU的人绒毛膜促性腺激素（hCG）（静脉注射）、3.15 mg或6.3 mg的醋酸布舍瑞林（皮下注射）进行诱导排卵，然后在诱导排卵注射后的16 h（hCG）或18 h（醋酸布舍瑞林）进行人工输精，若在22～24 h时仍未排卵，则在36～38 h时再输精1次。在用甘油作为抗冻剂，并在解冻后用精浆进行重新稀释精液的情况下，获得61.5%的冻精情期受胎率。Oliveira等［5］则在卵泡发育至直径为33～35 mm时，肌注1 mg醋酸德舍瑞林进行诱导排卵，注射后24 h开始输精，并每8小时输精1次，直至排卵，结果子宫角深部输入冻精的受胎率为28.26%。

3 精液类型对受胎率的影响

用于驴人工授精的精液有鲜精、低温保存精液（4℃）和冻精，从现有的研究结果来看，人工授精的情期受胎率基本上都是鲜精＞低温保存精液＞冻精。Rossi等［2］用脱脂奶粉-葡萄糖稀释液稀释鲜精，马上输精和5℃保存12 h后输精的情期受胎率分别为64.52%和50.72%。张瑞涛等［6］用Tris-柠檬酸-葡萄糖-卵黄稀释液稀释精液，人工授精后鲜精的情期受胎率为35.2%，4℃保存24～72 h后的情期受胎率为29.7%。Vidament等［4］将用奶稀释的鲜精在4℃条件下保存（不超过8 h），情期输精后母驴受胎率为45%（9/20），而用含有2.2%甘油的E2稀释液稀释冷冻的精液，输精后的情期受胎率则只有 11%（4/38）。杨莉等［24］也对冷冻精液、低温保存精液和鲜精的受孕情况进行了研究，结果表明，母驴情期受胎率分别为23.88%、29.67%、35.28%。

4 输精量和有效精子数对受胎率的影响

对于输精量的多少，不同的研究其报道的量也是不同的，少的只有 4 mL［4］，多的则达 22 mL［3］。由于人工输精后母驴多会出现排尿，因此，在输精管残留可以忽略不计的情况下，输精量应该越少越好，这样就可以减少输精后排尿造成的精液倒流。若输精管较粗，输精后精液在输精管内残留较多，则输精量不可过少。至于合适的输精量，还没有见到相关的研究报道，还需依据所用的输精管来确定。

至于输入的有效精子数，不同的报道差异也很大，总的来说范围在3×108～10×108之间。可以想象的是，输入母驴子宫内的有效精子数越多，母驴的受孕机会就会越大。2016年，Oliveira等［5］用鲜精就有效精子数对母驴情期受胎率的影响进行了研究，发现在宫体内输精的情况下，输入的有效精子数为5×108时受胎率为40%，当有效精子数增加到10×108时，受胎率则提高到73%。

5 输精次数和间隔时间对受胎率的影响

由于驴卵子和精子维持受精能力的时间还不明确，致使输精的次数和间隔时间也各不相同。一般情况下，当卵泡直径达到30～35 mm时开始输精，间隔时间有的为 24 h［4，7］，有的为 48 h［3］；有的只在排卵前输精［4-7，24］，有的则在排卵前和排卵后均输精［1，22］。由于输精开始的时间、间隔的时间以及停止的时间不同，自然输精的次数也就各不相同。

从驴人工授精的研究结果来看，驴精子维持受精能力的时间相对较长，新鲜精液的精子维持受精能力的时间可能达到3～5 d［25］，但低温保存精液和冻精能不能达到还值得怀疑，需要进一步的研究。从其他动物的经验看，冻精维持受精能力的时间和存活时间都较鲜精有明显的缩短。至于驴卵子维持受精能力的时间，易理辉等［26］认为较马更短，他们从实践中得到的经验是驴的输精需要在排卵前进行，排卵后输精一般无效。马卵子维持受精能力的时间一般不会超过 12～15 h，多数只有 2～6 h［25］，相信驴的比这更短。

6 输精部位对受胎率的影响

Oliveira 等［5］、杨莉等［24］进行了输精部位对驴受胎率的影响的研究，发现子宫角深部输精的受胎率均比子宫体内输精显著提高。Oliveira等［5］应用冻精进行了试验研究，结果子宫体内输精的情期受胎率为0%，子宫角深部输精的受胎率则达28.26%。杨莉等［24］则采用鲜精进行了试验研究，结果发现子宫体内和子宫角深部输精的情期受胎率分别为33.33%和45.16%。这些试验表明，精子距离受精部位越近，精卵结合越容易，受胎率越高。

除了直肠引导深部子宫角输精（TRG）外，近年来还有人用内窥镜对深部子宫角输精（HYS）进行了研究。Lindsey 等［27］的研究发现，用 HYS（5/10，50%）比 TRG（0/10，0%）的受孕率高；而 Brinsko 等［28］、Lindsey 等［29］和Hayden等［30］的研究则显示，HYS和TRG两种授精方式的受孕率差异不显著（P＞0.05）。

7 结语

驴的人工授精技术还不够成熟，还需要在理论上和实践中进行进一步的研究，特别是冻精的人工授精。但不管怎样，从先前的研究可以看出，提高输精时间的准确性以及精卵相遇几率的措施均能够提高驴人工授精的受胎率。未来仍需要在排卵时间的精确确定、优良稀释液和子宫角深部输精实用器具的开发以及成套技术体系的建立等方面进行更加深入的研究。