“功效成分组”在中药毒/效物质基础研究中的应用

李芸霞，彭成

药物的三性包括安全性，有效性和质量可控性。中药，作为我国传统中医药治疗疾病的主要方式，有着深厚的文化底蕴和社会基础, 同时具有丰富的实践经验、确切的临床疗效和完整的理论体系,为中华民族的健康与繁衍做出了不可磨灭的贡献,其有效性已经得到反复的确证。然而，近年来关于中药质量和临床疗效不稳定、毒副作用的报道逐渐增多，中药安全性研究已成为中药国际化的技术壁垒。SFDA也对高风险类药品开展/ 再评价工作，究其原因在于中药药效物质基础不明, 药品的安全、有效、质量可控就成了无源之水、无本之木。因此, 中药药效物质基础的研究是中药安全性和质量控制的基础与核心, 也是中药新药创制急需解决的核心问题。

1 中药药效物质基础研究进展

中药药效物质主要指中药（包括单味药、复方）中的活性成分或有效组分。通过中药药效物质的研究，阐明中药有效成分及其作用机制，揭示中药发挥临床疗效的科学内涵及独特作用规律是保证中药质量稳定可控的前提，也是开发具有自主知识产权创新中药的源头。而中药多成分、多靶点、多途径的作用特点，决定了揭示中药药效物质基础的难度和复杂性。目前针对中药药效物质基础研究已提出了多种方法和假说。

如薛燕教授等[1]提出的中药复方霰弹理论认为：中药复方中多种成分在体内同时作用于多个部位和靶点，通过多种途径来治疗疾病。周俊院士[2]认为中药复方是根据中医理论和实践以及单味药功能主治性味,通过人工组合形成的具有疗效的相对安全的天然组合化学库,具有多靶作用机理特征。高月研究员等[3]提出的 “分子中药组学”认为中药复方是通过化学成分组合影响到信号分子组合, 使紊乱的信号分子网络恢复平衡, 从而起到治疗中医的“证”和相关疾病的作用和效果。李爱秀教授[4]在李石生教授等人的中药“分子药性假说”基础上提出“药效团药性假说”，认为药物分子与某个受体产生相互作用时所具有的“特定药效结构，决定了中药对机体作用的多靶点作用机制。彭成教授[5]提出中药配伍“一个核心,两个环境、三个性质、四个层次”的观点,以提高疗效为核心，着重内环境和外环境，坚持中药的复杂性、相对性、可控性，从药队配伍、饮片配伍、组分配伍、成分配伍四个层次研究中药的增效减毒与调控。蔡少青教授[6]提出中药药效物质的“显效形式”、“叠加作用”和“毒性分散效应”理论假说，探索中药有效低毒的本质。张伯礼院士、王永炎院士[7]在《组分配伍研制现代中药的理论与实践--方剂关键科学问题的基础研究》一书中对“组分配伍”的概念的总结以及复方丹参方、清开灵、血府逐瘀汤等的研究为中药复方的现代化研究奠定了基础，对发展创制现代中药有着示范性的启示。

我国学者积极引入现代科学技术， “证治药动学”[8]、 “中药胃肠药动学”[9]及“中药血清药物化学”[10]等理论假说的出现大大丰富和活跃了中药药效物质基础研究工作。黄熙教授等提出的“证治药动学”理论假说是指同一药物作用不同的中医病证时其药动学参数存在统计学差异,体现了中药 (复杂系统) 与人体 (复杂系统) 的相互作用的动态关系。杨奎教授等提出的“中药胃肠药动学”研究胃肠道环境 (pH 值、肠道细菌及消化酶等) 因素对中药方剂有效成分溶出、吸收和代谢的影响, 揭示各有效成分间协同或拮抗的规律。王喜军教授提出的“中药血清药物化学”，以血清中入血的有效成分或移行成分为指标,通过有效成分与药效的相互关系来反映中药传统方剂的配伍原则和药物的量效关系。王广基教授提出了中药体内外药效物质组生物/化学集成表征新方法[11]，刘昌孝院士、李川研究员等应用药代标示物[12-13]和文爱东教授等应用药效差示血清色谱法[14]等从不同角度、不同层次论述了中药药效物质基础的研究思路和方法, 促进了中药药效物质基础研究的发展。

近年来,伴随血清药物化学的发展和后基因时代的代谢组学、网络药理学出现,使认识中药体内直接作用物质及其与病证生物标记物成为可能, 为阐述中药药效物质基础提供了方法学可能。肖培根院士[15]指出中药的现代化是指将传统中药的特色优势与最新的现代化科学技术密切结合, 明确中药及其复方在体内作用的物质基础及药理作用机制, 使药材质量达到稳定可控, 能够开发出具有中医药特色的治疗复杂疾病的新药。刘昌孝院士[16]提出代谢组学将助推中药现代研究，认为在现代中药研究中，代谢组学在药物有效性和安全性、中药资源和质量控制研究等方面具有重要的理论意义和应用价值。罗国安教授[17]认为生物机体系统受中药系统作用后将会在内源性代谢物组上产生的应答, 可间接地反映药代动力学的特征[18]，并通过代谢组学研究方法研究热性中药川芎对寒凝证潜在生物标志物的影响，探讨川芎治疗寒凝证的作用机制[19]。许国旺教授等[20]基于UFLC/MSIT-TOF的代谢组学方法, 构建了过度疲劳与抑郁大鼠的内源性生物标志物网络,揭示了其代谢紊乱过程。贾伟教授等[21]采用代谢组学研究方法开展了中药马兜铃酸致肾毒性及中药方剂（左金丸）治疗大鼠结肠癌癌前病变机理研究。唐惠儒教授等[22]进行了黄曲霉毒素导致的肝纤维化和肝癌的一些内源性代谢物变化研究, 结合KEGG、Metacyc 等数据库揭示其致毒机制。而网络药理学[23]是系统生物学和多向药理学的融合与发展，用计算方法研究中药中化学成分的多靶标、多途径协同作用，并用网络的形式直观呈现出这种复杂作用。徐筱杰教授等[24]应用网络药理学方法探讨清热中药治疗冠心病作用机制,研究清热中药中化学成分与相关靶标的相互作用，初步揭示了中药分子基础及复杂的作用机理。李梢教授等[25]提出中医药系统生物学的概念，并基于网络生物学方法构建了神经内分泌免疫 (NEI) 网络并提出中医证候生物分子网络标志的构想。在2014年Science推出的中医药特刊发表的系列文章中也从不同方面中医药与现代科学技术包括系统生物学等进行了回顾和总结。

2 “功效成分组学”概念的提出

中药的功效是对在中医药理论指导下的对疾病的治疗作用和保健作用的精炼总结。而建立在阴阳学说的中医临床医学，针对“阴阳失调”的病理状态进行治疗，基于这种理论用药并从中总结出来的功效，应当属于“治疗”功效。因而中药的治疗功效历来占绝大多数。随着临床用药经验的积累，主治范围的扩大，以及中医病因病机学说和辩证理论的逐渐深入，中药的治疗功效也向纵深发展，大体可分为“对证治疗功效”、“对病治疗功效”和“对症治疗功效”[26]。“证”是中医学的特有概念，是对疾病所处一定阶段的病因、病性、病位等做出的综合性概括。辨证论治是中医学的显著特征，通过这种医疗实践而产生的中药对证治疗功效在各类功效中占主导地位，其既是各药性能产生的基础，又是临床用药的主要依据。如：麻黄发散风寒，可推导其药性为辛温，归肺经，又可确定其主治为风寒表证。

功效是中药预防和治疗疾病的基本作用，药物的性能是对功效性质和特征的进一步概括，主治和应用则是各种功效适应的病证和用药方法，中药研究的关键应以功效为核心。不同的功效描述意味着针对不同证的治疗作用，体现了机体和药物的相互关系。然中药成分复杂，功效多样。针对不同证型，起效部分可能是其中的某一组分群，而其它与之不相关的组分则是其副作用甚至毒性效应的诱因。应用整味药材作为研究对象进行药效物质基础研究，缺乏对生物机体、中药成分与药效改变的整体联动性以及组分间存在复杂的相互作用关系的考虑，在研究中药药效物质基础的安全性与有效性方面存在一定的局限。在此基础上，课题组提出“功效成分组”的概念。认为中药自身即为小的药物库，内含不同种类化学成分。不同成分功效在治疗病证时发挥不同功效，或为治疗成分，或为无效成分，或为有害成分。成分间可能存在协同、拮抗或者单行的关系。并在国家自然科学基金重点项目-“附子’毒与效’的多维评价与整合分析研究(81630101)”、面上项目-“司外揣内”活性成分谱桥接生物体代谢响应网络探究附子治疗心阳虚型慢性心衰的药效物质基础及作用机理(81573583)、多组分多靶点动态网络调控驱动效应模型研究连翘“清热解毒”的药效物质基础和协同作用机理(81373943)、青年项目-连翘清热解毒药效物质基础的“谱证动力学”研究(811027943)的等的连续资助下，对附子及连翘的功效成分组进行了相关研究，旨在为中药的药效物质基础研究提供新的思路与方法，并探索中药整体功效及其作用本质奥秘的关键所在。

3 “功效成分组学”在中药药效物质基础研究中的应用

3.1 附子功效成分组研究

附子具有回阳救逆，温里散寒的功效，被称为“药之四维”，千百年来都是防病治病的重要药物。据初步统计，列入国家社保目录的中成药中，以附子作为主要原料的就有20多个。附子主要用于" 身凉肢冷，脉微欲绝" 以" 回阳救逆"。脉微欲绝与心衰和休克有关，而温里散寒功效在与类风湿性关节炎相关。课题组对附子进行了长期的研究，在彭成教授“毒性物质基础-毒作用机制-控毒方法体系”的有毒中药安全性研究的思路和模式的指导下，对附子的基础毒理、特殊毒性、安全毒理等进行了研究，发表专著《有毒中药附子、川乌、草乌的安全性评价与应用》[27]。在前期研究的基础上，我们提出以功效为导向的附子功效成分组并予以实践研究。

药理实验研究发现在正常大鼠体内实验时，附子脂溶性生物碱具有明显的毒性，在12mg/Kg剂量时就能出现死亡，在急慢性心衰大鼠体内，水溶性生物碱在治疗心衰方面效果显著。给药后，心衰大鼠的畏寒喜暖、弓背蜷缩、体毛枯疏、阴囊皱缩、睾丸回升、肛周污染、饮食减少、活动减少、反应迟钝、死亡及死亡时的表现(如腹水)等症状明显减轻。与正常大鼠比较，心衰大鼠灌胃附子水溶性生物碱后，可显著性降低各时间点大鼠血浆中ANG-II、ALD、ANP、ET、NT-proBNP水平。

课题组对附子总生物碱在正常大鼠体内、附子水溶性生物碱在正常和急慢性心衰大鼠的体内过程进行药动学研究。9.6，19.2，38.4 mg﹒kg-1灌胃大鼠附子总生物碱后[28]，采用UHPLC-Q-TOF-MS 测定不同时间点血浆中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱和乌头原碱的血药浓度，绘制药-时曲线，计算药动学参数。与低剂量组比较，中、高剂量组上述7 种生物碱类成分的药峰浓度(Cmax) 和药时曲线下面积AUC0-∞升高，大部分差异有统计学意义; 表观分布容积/生物利用度( Vz/F) ，清除率( CL /F)，半衰期( t1/2)和达峰时间( Tmax) 则大部分无明显变化。表明剂量对附子总生物碱在大鼠体内的药动学特征有显著影响，附子总生物碱的体内过程基本符合线性动力学特征。

附子水溶性生物碱在正常大鼠和模型大鼠体内过程符合线性动力学特征，疾病状态可明显影响水溶性生物碱的体内过程[29]。大鼠的畏寒喜暖、弓背蜷缩、体毛枯疏、阴囊皱缩、睾丸回升、肛周污染、饮食减少、活动减少、反应迟钝、死亡及死亡时的表现(如腹水)等心衰症状明显减轻。急慢性心衰大鼠体内的, 盐酸多巴胺、尿嘧啶、去甲猪毛菜碱、尿苷、鸟苷、去甲乌药碱的 Cmax、AUClast明显升高。结果显示，附子水溶性生物碱对大鼠急慢性心衰均有一定的治疗作用，在对证的前提下，附子水溶性生物碱的血药浓度增加表明体内吸收增加，能达到更好的治疗效果。

之后课题组采用UPLC-Q-TOF-MS/MS代谢组学结合多元统计分析和模式识别技术研究附子在治疗心衰时的毒效物质基础。脂溶性生物碱组10 mg/kg灌胃给药，水溶性生物碱组2g/kg连续给药一周后，采集血浆样本，建立总离子流色谱图(TIC)，对数据进行解卷积和峰对齐，数据归一化处理，然后进行主成分分析(PCA)，偏最小二乘方-判别分析（PLS-DA），差异代谢物韦恩图(venn)分析，差异代谢物热图(heatmap)分析等，鉴定差异代谢物并进行毒效机理分析。鉴定得到10个代谢标志物：L-Arginine, L-Carnitine, Indoxylsulfuric acid,L-Tryptophan, L-Methionine, 1-Linoleoylglycerophosp hocholine, DL-pipecolic acid, Pyrrolidine, beta-Alanine,L-Valine。经通路分析，推测脂溶性生物碱的毒性可能与Pantothenate and CoA biosynthesis（泛酸和辅酶A生物合成）; beta-Alanine metabolism（β-丙氨酸代谢）; Propanoate metabolism（丙酸代谢）; Pyrimidine metabolism（嘧啶代谢）; Valine, leucine and isoleucine biosynthesis（缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸生物合成）; Valine, leucine and isoleucine degradation（缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸降解）; AminoacyltRNA biosynthesis（氨酰-tRNA合成）等代谢通路有密切关系。慢性心衰使大鼠机体的Aminoacyl-tRNA biosynthesis（氨酰-tRNA合成）, Arginine and proline metabolism（精氨酸和脯氨酸代谢）, Cysteine and methionine metabolism（半胱氨酸和蛋氨酸代谢）等发生紊乱。水溶性生物碱可通过调节慢性心衰大鼠的氨酰-tRNA合成,精氨酸和脯氨酸代谢,色氨酸代谢,及赖氨酸降解等代谢途径，对其发挥一定的治疗作用。

课题组进一步在分子层面对附子水溶性生物碱对心力衰竭大鼠心肌细胞膜ATP酶以及相关离子的影响进行研究。取新生大鼠心室肌细胞原代培养5d至细胞成熟，用0.8%戊巴比妥钠作用5 min造心衰细胞后，分别给予附子水溶性生物碱0.01，0.02，0.04 g﹒L-1。结果显示，附子水溶性生物碱各剂量组均能提高心衰细胞的细胞活性,并能升高模型细胞Na＋，Mg2＋含量，提高细胞内Ca2＋-ATP酶和Ca2＋-Mg2＋-ATP酶的活性，降低K＋，Ca2＋的含量与Na＋-K＋-ATP酶的活性，说明其对戊巴比妥钠致心衰细胞模型具有一定的治疗作用[30]。

综上，课题组对附子研究结果表明在脂溶性生物碱显示出较大的毒性，而水溶性生物碱是治疗心衰的有效成分，提示若针对心衰治疗时工业生产中能否将脂溶性生物碱和水溶性生物碱进行分别提取，针对不同证型给药以减少其毒性作用。同时课题组也对临床常用于急救的参附注射液成分进行研究，发现参附注射液里只能检测到附子水溶性生物碱成分，而不含有脂溶性生物碱，从而也证明了我们的假想。

3.3 连翘功效成分组研究

连翘为木犀科植物连翘的干燥果实，被喻为“疮家圣药”。具有清热解毒，消肿散结，疏散风热的功效。其中疏散风热可与清热联系，消肿散结与解毒联系，因此连翘的功效可简单概括为“清热、解毒”。中医认为，清热解毒之“毒”为火热壅盛所致的“热毒”或“火毒”，主要为温热病及热毒炽盛症。现代医学研究认为，清热解毒中药所解之“毒”包括细菌、病毒、内毒素等“外源性之毒”和氧自由基、细胞因子等“内源性之毒”。连翘为典型的清热解毒药，可用于温热病的各个阶段。现在药理研究表明其具有抗炎、抗病原微生物、解热镇痛、镇吐、保肝等作用。

连翘主要含有木脂素类、苯乙醇苷类、挥发油、黄酮类、有机酸、生物碱等，按组分类别分为连翘提取物和连翘挥发油。连翘提取物是中国药典记载的连翘水提醇沉物，保留了苷类、有机酸类、氨基酸、生物碱等成分，而去掉了挥发油部位和杂质。而连翘挥发油在研究中常常被忽略，在现有的制备工艺过程中也容易流失。根据已有的报道，连翘清热解毒功效缺乏整体性研究，偏重于主要成分或者某个提取部位，且连翘提取物和挥发油相当于将连翘有效组分一分为二的两个部分，尚没有两者药效、机制的关联性或进行比较的相关报道。因此，对于这类多组分-多靶点的中药，有必要进行重要部位间相关的药效比较或者协同性研究，同时阐释其多组分-多靶点的特点和机制。

连翘为单品种来源药材，但根据采收时间不同可分为青翘和老翘，但临床上对不同商品规格的药材应用并没有区分。研究首先对不同产地来源的连翘进行了指纹图谱研究，考察不同产地、采收时期、加工方法的15批连翘药材的各成分情况，建立连翘指纹图谱，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统和聚类分析进行数据分析。研究结果发现青翘与老翘的化学组成相似，但青翘的各成分含量相对老翘更多；主产地山西临汾和河南卢氏的连翘化学成分组成比其他地方的含量高；同一产地的水煮晒干的青翘比直接晒干的青翘的化学成分含量更高。在规范了药材来源基础上，课题组制备了连翘提取物和挥发油进行清热解毒功效研究。

以证为出发点，课题组建立不同热证模型[31]：皮下注射干酵母致大鼠发热模型、腹腔注射脂多糖（LPS）致大鼠发热模型、皮下注射2,4-二硝基苯酚致大鼠发热模型，给予连翘提取物及挥发油高中低不同剂量，研究其解热功效。并在此基础上，选择发热稳定的干酵母致大鼠发热模型，进行代谢组学及相关机制研究。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS结合多元统计分析和模式识别技术对酵母致发热大鼠分别经连翘提取物和挥发油治疗后经行血清代谢组学分析，挑选潜在的代谢标志物来揭示连翘提取物和挥发油的解热机制。通过与模型大鼠的比较，研究发现连翘提取物和挥发油均能显著的扭转发热大鼠的代谢紊乱。8种代谢物被筛选出来，包括鞘氨醇、胞嘧啶、亮氨酸、蛋氨酸、溶血磷脂胆碱、L-乳酸、已二酸和3-羟基丁酸。结果表明，连翘的解热机制可能涉及“半胱氨酸和蛋氨酸代谢”、“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成和降解”、“酮体的生成和降解”、“丁酸代谢”。这些结果进一步说明，连翘的不同组分在治疗酵母所致大鼠发热时具有协同作用。同样建立角叉菜胶致大鼠足肿胀模型、鸡蛋清致大鼠足肿胀模型、大鼠棉球肉芽肿慢性炎症模型[32]，给予连翘提取物及挥发油高中低不同剂量，研究解毒（抗炎）功效。并在此基础上，基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的代谢组学方法，通过研究连翘提取物和挥发油治疗角叉菜胶致足肿胀大鼠后血清代谢物改变来系统地阐明连翘抗炎机制[33]。13个代谢标记物被筛选出来，包括PC (19:0/0:0)、LysoPC (20:0)、LysoPC (20:1)、LysoPC (17:0)、鞘氨醇、亚油酸、3R-羟基-丁酸乙酯、2-羟基十六烷酸、乳酸、L-苏氨酸、L-亮氨酸、马来酸、己二酸。根据KEGG通路图得到连翘抗炎对代谢通路影响的网络图，进行metaboanalyst分析，连翘提取物组影响的主要代谢通路有亚油酸代谢、缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、鞘氨醇代谢、甘油磷脂代谢，连翘挥发油组影响的代谢通路有鞘氨醇代谢、甘油磷脂代谢）。

课题组进一步采用分子对接和药理实验方法筛选连翘的主要药效成分。以JAK/STAT信号通路为例，课题选取JAK/STAT信号通路网络中的关键节点作为研究靶点。根据相关文献主要选取了细胞因子信号抑制因子家族（SOCS）、蛋白质酪氨酸磷酸酶家族（PTPS）等相关靶点进行研究。由连翘与JAK/STAT信号通路相关各靶点的对接得分可以看出中药连翘的抗炎作用整体较好，提取物中苯乙醇苷类、木脂素类以及挥发油类成分与该通路的多个蛋白靶点结合较优，尤其是苯乙醇苷类成分在该通路上显示出了明显且广泛的多靶点抗炎作用。苯乙醇苷类成分中得分较高的成分主要为连翘酯苷类，以连翘酯苷A（Forsythiaside A）和连翘酯苷B（Forsythiaside B）的得分较高，并且连翘酯苷A和连翘酯苷B与JAK/STAT信号通路的多个靶点结合的得分均优于其相应的阳性结果；木脂素类成分中以连翘脂素（Phillygenin）、连翘苷（Phillynin）得分较高，其中连翘脂素与该信号通路的多个靶点对接得分均高于阳性对照；挥发油类成分中α-蒎烯、β-蒎烯对接得分较高，此外，环烯醚萜类如Forsythide、Adoxosidic acid等与该信号通路的一些靶点也显示了较好的结合。从对接得分情况来看其结果与相关文献研究结果推测的连翘抗炎成分相吻合。

结合虚拟筛选结果，采用药理实验结果进行验证。研究发现连翘的主要解热药效成分为连翘脂素＞连翘酯苷＞连翘苷，机制与提取物和挥发油均能显著降低下丘脑中cAMP含量有关，同时连翘提取物能显著降低下丘脑中PGE2含量[34]。抗炎药效成分为连翘脂素、连翘酯苷A及连翘酯苷B显示较强的抗炎活性，同时推测其抗炎机制可能与抑制TNF-α和IL-6这两种炎症因子的生成和多成分作用有关[35]。课题组整合计算机模拟及组学等最新技术，通过对连翘的功效成分组体内外不同层次的系统研究确定了连翘的主要药效成分及其在清热和解毒功效方面起多靶点协同增效的作用，提示在连翘药材提取过程中对于连翘的挥发油和提取物都应尽可能提取，以保证药效的最大程度发挥。

此外，课题组还对大黄在治疗便秘时的功效成分组进行了研究。大黄作为传统的泻下药，治疗便秘十分有效。其主要成分大黄游离蒽醌、结合蒽醌、大黄鞣质和大黄多糖，然而哪种成分才是大黄治疗便秘的有效成分却不清楚。课题组建立大鼠便秘模型，分别给药大黄游离蒽醌、结合蒽醌、大黄鞣质和大黄多糖，进行形态学、病理学观察及胃肠激素测定，进行大黄治疗便秘的药效成分筛选。研究发现，大黄含有的多种成分，其中大黄结合蒽醌有泻下的作用能治疗便秘，而鞣质有止泻作用。因此，大黄在长期应用的过程中，容易引起继发性便秘。若在临床上使用不含大黄鞣质的药品，可能降低其不良反应的发生率。因此，课题组以大黄结合蒽醌含量为标准进行不同产地药材质量考察，进行了工艺优化，并提出一种以疾病为基础、以药效为指导的中药有效成分研究方法来进行中药质量控制[36]。

4 结语

在中药的系统研究中，药效物质基础的确定是整个研究的核心所在。药效物质基础确定，药材品种、栽培、采收、炮制、配伍、贮藏等各环节才有了客观的评价标准，而中药的质量可控后才能谈安全性和有效性问题。是药三分毒，在机体不需要的情况下，再好的药也会产生毒副作用。功效成分组概念的提出，将有助于中药的标准化研究。对于不同功效成分的提取不仅有助于“辨证施治”的中医药理论发展，同时能帮助去除与疾病无关的成分或有害成分，并能充分利用中药资源，有利于绿色中药的持续发展。

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