鱼类肠道菌群与免疫力的相关性研究

罗亮，赵志刚，都雪，徐奇友

（中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070）

肠道菌群作为生物体“被遗忘的器官”在生命活动过程中发挥着重要的作用，其含有的几百万个基因也被称为生物体的“第二基因组”[1]。机体肠道内大量而复杂的微生物在演变和适应过程中逐渐形成了肠道菌群。鱼类受环境的影响和作用，肠道内进化出与所处环境相适应的正常菌群[2]。鱼类肠道中这些有益菌群分泌多糖、脂类、维生素、相关活性酶类等一系列代谢产物，共同促进了免疫系统的作用。这些有益微生物占优势时，抑制了病原微生物的生长，提高了鱼体的抗病能力，肠道正常菌群就像一道屏障保护鱼体健康生长[2,3]。鱼类肠道菌群在促进建立机体免疫、屏障致病菌入侵、提高营养物质吸收与利用等方面起重要作用[4]。近年来，肠道菌群与宿主健康的关系已成为研究热点，作为人类路线图计划（road map plan）一部分的人体微生物群系项目（Human Microbiome Project，HMP）、欧盟资助的“人类肠道宏基因组计划”都在如火如荼地进行，而且取得了很多重要研究成果[1,5-7]。为提高健康水产养殖的经济和生态效益，也围绕着鱼类肠道菌群形成、组成和种类及影响因素、生理功能、与机体免疫相关性等方面开展了一系列研究。本文着重讨论了鱼类肠道菌群结构与免疫力相关性的研究进展。

1 鱼类肠道菌群的形成

肠道菌群与宿主关系密切，了解肠道菌群在宿主发育过程中的变化是揭示肠道菌群形成的关键。有研究者认为，肠道菌群与宿主间的复杂相互作用始于宿主出生之后[8]。Hansen等[9]测定了鳕Gadus morhua L.和鲽Hippoglossus hippoglossus卵中的菌群，发现在鱼卵阶段由于其消化腺还没有形成，不存在菌群定植情况。鱼类发育早期肠道微生物群落的形成和组成目前仍不清楚[10]。鱼类胚胎在卵膜内无菌环境中发育孵化，只有破膜而出接触外界环境及获得开口饵料后，肠道内的菌群结构才开始形成[10,11]。Sugita等[12]研究发现，罗非鱼Oreochromis mossambicus仔鱼在孵出20～60d后，肠道内开始有菌群定植。他们推断这些细菌来自养殖水、底泥或其他鱼类粪便等外界环境。史秀清等[13]研究了影响大菱鲆Scophthalmus maximus仔稚鱼发育早期肠道菌群结构形成的因素，发现其肠道菌群结构在开口摄食后不久就趋于稳定。大菱鲆仔稚鱼肠道对定植的菌种具有选择性，一些水环境和饵料中的非优势菌也会定植于肠道，成为大菱鲆肠道中的次优势菌。仔稚鱼时期肠道菌群的定植对后期菌群的形成与发展具有重要的影响[14]。Roeselers等[15]研究发现，斑马鱼Danio rerio饲养在不同条件下肠道菌群中存在着相似的核心微生物组群。

也有部分研究者比较研究了鱼类整个生命周期肠道菌群组成的变化。Stephens等[16]从受精卵到成鱼7个特定时间采样，发现不同生长阶段的斑马鱼肠道菌群结构不同。Li等[17]分析了银鲫Carassius auratus gibelio在不同发育阶段的肠道菌群组成，结果表明随着鱼类的发育，肠道菌群多样性显著增加，在相同环境及投喂情况下，不同发育阶段的银鲫肠道菌群组成有所改变。肠道菌群的一些特征可能由宿主的发育决定。鱼类不同发育阶段的肠道菌群形成受到各种外界环境因素的共同作用和影响。

2 鱼类肠道菌群的数量及组成

种类、生长与栖息环境、是否投饵、投饲策略、肠道自身生理特征等因素均影响鱼类肠道菌群的数量和组成，这些因素间既统一又相互作用。有研究表明，淡水鱼肠道内细菌数量在105～108CFU·g-1之间[12,18]，而海水鱼肠道内细菌数量在106～108CFU·g-1之间[19]。Turst&sparrow[20]曾指出，鱼类肠内细菌的数量与肠道组织的关系比与肠道内容物的关系更密切。不同种类的鱼肠道菌群组成也各不相同。李学梅等[21]采用PCR-DGGE指纹技术研究了斑点叉尾Ictalurus punctatus、银鲫和异育银鲫Carassius auratus gibelio肠道微生物群落，结果发现，在斑点叉尾肠道中检测到的菌群主要是变形杆菌门Proteobacteria，而银鲫和异育银鲫肠道中菌群主要包括梭杆菌门Fusobacteria中的类群，还包括变形杆菌门中的气单胞菌Aeromonas，以及一些未知的类群。所研究的不同种类鱼幼鱼肠道菌群组成不同，这种差异受基因型的影响可能更大。黄丽丽等[22]利用16S rRNA高通量测序方法比较了新疆冷水鱼肠道中微生物多样性，结果发现不同种鱼肠道微生物的组成及多样性在门和属水平上有明显差异，而同种冷水鱼的肠道内容物和黏膜间微生物群落组成较为相似，无显著差异。鱼类生长或栖息的环境和其所摄食的饵料是影响鱼类肠道菌群中微生物数量和组成最重要的两个因素。周志刚等[23]利用PCR-DGGE指纹图谱分析比较了川纹笛鲷Lutjanus sebae及圆白鲳Ephippus orbis消化道壁的优势菌群结构，结果发现两种鱼消化道壁的细菌多样性及相对丰度有明显区别，圆白鲳消化道壁细菌多样性高于川纹笛鲷，这可能归因于它们天然栖息地的差异性。白晓慧[24]研究认为，消化酶活性在鱼的生长发育过程中起重要作用。消化酶的活性随水环境的变化而改变。尹军霞等[25]对鱼食性与肠道菌群关系的研究发现，乌鳢Channa argus、鲢Hypophthalmichthys molitrix、鳊 Parabramis pekinensis、鲫Carassius auratus等4种不同食性鱼的后肠壁和后肠内容物中厌氧菌总数远大于好氧菌总数，后肠内容物菌数远大于后肠壁菌数；不同的鱼后肠壁的好氧菌总数差别很大（如鲢后肠壁好氧菌总数7×1010CFU·g-1，而鲫后肠壁好氧菌总数为1.2×109CFU·g-1，前者是后者的58倍），而厌氧菌总数差别不大（最大数鳊与最小数鲢之间的比值仅为2.4倍）。

3 鱼类肠道菌群与黏膜免疫

鱼肠道内栖息着大量的正常菌群，它们覆盖在肠道表面黏膜上，形成一道天然拮抗致病菌入侵的机械屏障，同时刺激机体产生非特异性和特异性免疫反应，与宿主共同维持内稳态的平衡，加强对机体的免疫保护[3,26]。Gallo等[27]研究认为，肠道内的正常共生菌群可以分泌一些具有抑菌活性的物质，抑制病原微生物在肠道黏膜内生长、定植。Bergh等[28]研究指出，在鱼体表和肠道黏膜内定植的正常共生菌群作为屏障防止病原菌的入侵和寄居。如肠道中具有抑菌效果的乳酸菌可增强鱼类免疫，促进生长[29]。周金敏等[30]从黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco肠道筛选了病原拮抗性芽孢杆菌，并研究了其特性，结果发现菌株F14抗菌谱较广，抑菌作用强，耐高温和酸性环境，在饲料中稳定性好，具有做为水产益生菌的潜力。健康鱼肠道菌群的数量和种类处在动态平衡之中，病原菌不能过量繁殖，以免引起疾病。但是，当肠道正常菌群受到宿主各种因素刺激而失调时，病原菌就会趁机异常繁殖，导致宿主免疫能力降低而发病。张正等[31]分析发现，患病半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis肠道菌群中细菌种类数仅是同一养殖系统中健康鱼的45.8%和64.5%，病鱼肠道中细菌多样性明显下降。肠道正常菌群与肠道黏膜的共生互利关系在鱼类肠道黏膜免疫中具有重要的作用。

4 鱼类肠道菌群与细胞免疫

鱼类的细胞免疫包括迟发型变态反应、淋巴细胞直接参加的细胞毒性、移植物排斥反应、巨噬细胞游走抑制和混合淋巴细胞反应等[32]。凡参与免疫应答或与免疫有关的细胞均称为免疫细胞。固有免疫的效应细胞主要有单核/巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤（Natural killer,NK）等。它们具有吞噬和杀伤功能，也分泌免疫相关的细胞因子，介导炎症反应[33]。目前关于鱼类肠道菌群与细胞免疫间的相互作用研究较少。孙敬锋等[3]推测，鱼类肠道正常菌群对鱼类细胞免疫的调节作用主要在于对免疫系统发育的影响。李莉[2]研究了草鱼Ctenopharyngodon idellus肠道菌群组成结构的变化与免疫机能关系，发现随着草鱼肠道中气单胞菌属细菌比例下降而肠杆菌科Enterobaeteriaeeae细菌的含量上升时，草鱼白细胞的吞噬百分比和吞噬指数明显上升，这说明草鱼肠道优势菌群的变化可能与增强白细胞吞噬活性有关。利用益生菌鼠李糖乳杆菌L.rhamnosus JCM1136投喂虹鳟发现其肠道中的有益菌群比例提高，头肾白细胞的吞噬作用也显著增强[34]。

5 鱼类肠道菌群与体液免疫

体液免疫是指机体受抗原刺激后，淋巴细胞分化增殖，产生免疫球蛋白的应答过程[32]。鱼类体液免疫是鱼类免疫的重要组成部分，包括特异性和非特异性体液免疫。鱼类特异性体液免疫主要是指由淋巴细胞产生的一类免疫球蛋白，它能与相应抗原进行特异性结合。微生物生长抑制物、补体、干扰素、凝集素、溶菌酶和急性期蛋白等作为非特异性抵抗作用的分子存在于鱼类血液或粘液中[32]。葛莉莉[35]的研究发现，当对无菌动物进行常规的喂养或喂食益生菌后，机体肠道形态和免疫系统迅速反应，产生大量不同的针对肠道正常菌群的特异性抗体表型。王彦波等[36]在研究益生菌免疫调节作用机制时发现，芽孢乳酸菌09.712（Bacillus coagulans 09.712）在体外能显著提高对细胞的保护性，在体内能诱导斑马鱼产生先天免疫应答，提高斑马鱼的免疫力。陈勇等[37]应用环磷酰胺诱导建立了异育银鲫免疫抑制性实验模型，以研究添加壳聚糖或益生菌对异育银鲫免疫功能的影响。发现银鲫的IgM含量和头肾的溶菌酶活力均有不同程度的提高，适量的添加壳聚糖或益生菌能够不同程度地消除鱼类的免疫抑制。

6 结语

鱼类肠道微生物菌群与宿主的代谢、营养吸收、生长发育和免疫等密切相关，维持肠道正常菌群动态平衡对宿主正常生命活动至关重要。益生菌的利用研究主要集中在：一是用益微生物来调控养殖水质、底质，预防疾病；二是作为鱼饲料添加剂添，提高消化酶、免疫酶等活力，提高鱼机体免疫力。但是，肠道菌群与鱼类免疫的研究理念、技术手段还较落后，应深入研究肠道菌群与水产动物的免疫力二者之间的关系。