超声辅助冻结中国对虾的冰晶状态与其水分变化的影响研究

向迎春，黄佳奇，栾兰兰，余海霞，杨水兵，杨志坚，胡亚芹，，*

（1.浙江大学食品与营养系，浙江省农产品加工技术研究重点实验室，馥莉食品研究院，浙江杭州310058；2.浙江大学舟山海洋研究中心，浙江舟山316021）

从冰结晶理论来研究，水产品冻藏指在低温贮藏时水产品组织内水分从液态转变成固态的相变过程[1]。大气压的作用下，组织内水分在低于冰点以下开始结晶，液态到固态的转变引起体积增大，冰晶体对组织肌细胞膜等造成机械挤压及损伤，进而引起水产品冻结贮藏过程中发生一系列物理化学性质的改变。因此，研究水产品冻结过程中冰晶体的成核、生长过程及其生长分布规律，分析其与组织水分变化间的关系，将有助于进一步阐明冷冻水产品品质变化的原因，从而采取相应措施提高其在冻藏过程中的品质。

目前，人们常采用传统的冰箱对水产品进行冻藏保鲜，此方法得到广泛应用。为了提高热转移速率，人们也使用浸渍方式冻结，对于批量处理冻品，此方法能使冷冻食品温度快速均一地下降。对食品进行超声处理作为一种新型的加工技术，已被广泛地应用于食品加工的各个操作单元。其中，将低频超声波作用于浸渍冷冻过程，其形成的空化气泡通过移动和破裂可以诱导水分初次成核发生。此外，低频超声波还能促使已存在的冰晶发生断裂，形成均匀分布的小冰晶，从而促使二次成核发生[2]。关于冷冻过程采用低频超声波诱导不同物料中水分成核（包括初次成核和二次成核）在国内外已有报道[3-6]。此外，据报道，低频高强度超声波能改善冷冻过程中的传热效率，提高冷冻速度，防止大冰晶的生成，起到改善食品品质的作用[7]。也有研究表明，超声波能杀害食品中的部分微生物[8]，因此采用超声辅助冻结以保持食品的新鲜度具有广阔的应用前景。如今对高强度功率超声的研究主要集中在水果蔬菜的保鲜上，并证实具有较好的保鲜效果，而对超声辅助处理水产品的研究较少。水产品因其特殊的生理特性是食品领域中应用冷冻保藏最多的产品，传统冰箱冻结速度慢，形成冰晶大，对鱼虾蟹等品质影响较大。浸渍冻结虽传热快，但也会形成一定大小的冰晶破坏组织。而若采用超声辅助处理，能促使冻结的过程中形成小冰晶，对组织破坏较小，延缓冻品品质败坏，更长时间保持其新鲜度，其潜在的应用价值巨大。

水分变化作为新鲜水产品品质变化的直接影响因素，决定着产品的品质及经济价值。但是冻结过程中冰晶的形成与水分变化间的关系，它们是如何相互影响的还有待阐明。

中国对虾又名明虾，因其高蛋白、低脂肪、口感鲜美的特性深受消费者喜爱。但是其特殊的生理结构，使虾在打捞后不易存活，组织腐败极快，需采用特殊的贮藏方式延长其货架期。本研究以最常见的明虾为例，通过观察其在超声辅助冻结及浸渍冻结、传统冰箱冻结过程中的组织冰晶变化，综合其水分变化，探究冰晶形成与水分变化的相关性，对验证冰晶对冻品品质的影响具有科学指导意义，以期为明虾的冷冻加工提供提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活中国对虾：骆家庄农贸市场，选取个体重约（12±2）g，体表无损伤的活虾。保氧活体运回浙江大学食品加工研究所水产品资源利用与开发实验室后，进行不同条件的冻结处理。

乙醇、氨水、盐酸、苏木精伊红染液：国药集团化学试剂有限公司；OCT包埋剂：美国樱花OCT有限公司；低温粘着膜：Leica Biosystems公司。

1.2 仪器与设备

低温恒温超声机（定制）：宁波新芝生物科技股份有限公司；BS223S电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；HH-1数显搅拌恒温水浴锅：金坛市科杰仪器厂；Data Trace RF无线实时温度传感器：Mesa Laboratories公司；TGL20M台式低速冷冻离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；MDF-382E（N）三洋超低温冰箱：日本三洋电机株式会社；MODEL UB200i显微镜：重庆澳浦光电技术有限公司；CryoStar NX50冰冻切片机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 预处理

冻结曲线的测定：将热电偶探头插入虾体中心部位固定，分别将插入热电偶的虾每5只为一平行并排放入塑料袋真空包装。分别放入-20℃冰箱、-20℃低温恒温超声机（不开启超声）及-20℃低温恒温超声机中，待其温度降至-20℃停止超声，记录其温度变化的情况。

样品冲洗快速沥干表面水，每5只作为一组平行真空包装，放入恒温槽预冷至0℃。

超声辅助冻结（UF）：超声速冻机设置参数为频率45 kHz，功率180 W，开关5S ON/3S OFF，预冷的样品放入-20℃装有50%乙醇溶液的超声恒温槽中开启超声。分别在超声UF2组39 s（-2℃），UF3组169 s（-6℃），UF4组446s（-20℃）时及UF5组446s（-20℃）停止超声并放置恒温槽1 d时各取出两组置于液氮保温瓶终止其组织变化。

浸渍冻结（IF）：样品置于超声恒温槽中，不开启超声，待温度达到IF2组45 s（-2℃），IF3组 251 s（-6℃），IF4组 676 s（-20℃）时及 IF5组 676 s（-20℃）再放置恒温槽1 d时各取出两组置于液氮保温瓶终止其组织变化。

冰箱冻结（RF）：样品置于-20℃冰箱，待温度达到RF2组 310 s（-2 ℃），RF3组 3 786 s（-6 ℃），RF4组9 101 s（-20℃）时及 RF5组9 101 s（-20℃）再放置1 d时各取出两组置于液氮保温瓶终止其组织变化。

其中UF1组、IF1组、RF1组为未冻结时的新鲜对照样。以上3种预冻处理的样品液氮处理后均放置于-80℃冰箱保存待用。

1.4 冰晶形态分析（光镜观察）

1.4.1 肉样固定、切片、染色及观察[9]

1）将切虾肉的刀具预冷到-20℃，砧板四周撒上干冰尽量减少虾肉的受温度的影响，预冻结好的虾肉取第二节切成5 mm×3 mm×3 mm的立方体，3 mm×3 mm的横切面朝下浸入OCT包埋盒，放入液氮中迅速凝固包埋剂。

2）冷冻切片机切下6 μm的样品，用低温粘着膜吸附。

3）70%乙醇固定2 min，水洗；苏木素染色1 min，水洗；1%盐酸酒精溶液分化2 s，水洗5 min；氨水反蓝30 s，水洗；伊红染色3 min，水洗；贴于载玻片上封片。

4）制作好的切片在光镜下观察，选取适当放大的区域进行拍照，图片用ImageJ进行分析。每个平行组，选取100个以上有效冰晶进行分析。

1.4.2 面积（Cross-section Area of ice crystal or fiber muscle）[10-11]

标定像素与实际尺寸间的转换，利用阀值选出冰晶间隙区域，直接得出平均孔径面积及总面积。

1.4.3 当量直径（Equivalent diameter）

与研究对象具有相等面积圆的直径。

式中：A为孔径平均面积，μm2。

1.4.4 圆度（Roundness，R）

表示冰晶横截面接近于圆的程度。

式中：p为周长，R值介于0和1之间，值越大，对象越圆。

1.4.5 长度（Elongation）

冰晶横截面长轴长与短轴长的比值。其中，当长度为1时，对象是圆形或正方形；长度越大于1，对象越长。

1.5 解冻失水率测定[12]

称取预处理好的冻虾质量，然后放入4℃冰箱自然解冻后用滤纸吸干表面水分称重。

式中：W1为解冻前样品质量；W2为解冻后样品质量。

1.6 持水性测定[13]

水分含量：将2 g切碎样品平铺于水分测定仪，调节温度到105℃直至完全干燥，读取数据。

采用热离心法进行测定，取5 g虾肉置于离心管中，70℃水浴20 min，低速5 000 r/min离心3 min，倒掉水分，称重。

1.7 数据统计与分析

冷冻切片用带摄像机的显微镜拍照，用image J计算白色区域的孔径面积，相当直径，圆度，拉伸度。采用origin9.0和SPSS12.0进行数据处理及Person分析，不同处理间的比较采用显著差异法（LSD），显著性p＜0.05。

2 结果与分析

2.1 冻结曲线

一般来讲，冻结速度影响着冻品的品质，冻结速度越快，冻品品质相对越好，明虾冻结曲线见图1。

如图1所示为明虾在超声辅助冻结（UF）、乙醇浸渍冻结（IF）及冰箱空气冻结（RF）过程中的冻结曲线。虾体预冷到0℃后放入对应冷冻设备开始冻结。从图1中可以看出，虾体温度不断下降，开始阶段下降十分迅速，接近冰点时温度下降缓慢，经过-2℃时虾肉冻结曲线出现第1个拐点，即为虾肉的冻结点。在经过-6℃时，超声辅助冻结出现第2个拐点，在两拐点之间经过的时间为冰晶大量生成经过的时间[14]。从通过最大冰晶生成带的时间长短可以评价冻品冻结过程中的冻结速度快慢，从而评价形成冰晶的大小及对组织变化的影响。从图中可以看出不同冻结方式通过最大冰晶生成带的时间分别为超声130s，浸渍206s，冰箱3476s。其中，超声辅助冻结最快，比浸渍冻结提前76 s通过，比冰箱空气冻结提前3 146 s通过。林婉玲等[15]对凡纳滨对虾的研究有类似结果。冻结速度越快，组织内冰晶形成越细小，虾体组织内破坏越小，组织品质变化越小。此结果与李杰等[16]研究的南极磷虾、凡纳滨对虾、日本沼虾及秀丽白虾的冻结曲线有明显的差别，这可能与虾品种及冻结处理条件不同有极大关系。

图1 明虾冻结曲线Fig.1 Freezing curve of Penaeus chinensis

2.2 冷冻组织切片图

超声、浸渍和冰箱3种冻结过程中，达到不同温度时组织形态的变化情况见图2。

图2 -20℃条件下超声冻结与浸渍冻结、冰箱冻结组织形态变化对比（200倍）Fig.2 Changes of morphological with different freezing tissues（200 times）

用低温粘着膜辅助制作的冷冻切片组织清晰，冰晶孔径完好[17]。虾肉在4℃未开始结冰前，肌肉组织规则致密，HE染色后能看见清晰的组织纹路，细胞核大量分布在组织细胞内部。除了微小的白色结缔间隙外看不到其它明显的间隙。经过冷冻的组织变化明显，3种处理方式下的冷冻组织均受到一定程度的破坏。-2℃时，组织出现极少量的冰晶孔洞。理论上有大量晶核形成，但是冰晶形成不明显，对组织几乎没有破坏作用。各冻结组之间看不出明显的差别。随着冻结温度的降低，冰晶逐渐形成，在-6℃时有大量冰晶生成，此时各对照组冰晶均相对细小圆润。超声形成的冰晶相对细小均一，而浸渍冻结其次，冰箱冻结形成冰晶数量较少但是孔径大。当温度达到-20℃时组织冰晶数量增长趋于平缓，超声冻结组织冰晶形成相对多而细小均匀。当在-20℃贮藏1 d后可以看出，不同冻结处理方式对组织微观结构的影响有明显差异，超声辅助冻结组织结构相对致密，品质最好；冰箱冻结处理的组织冰晶引起间隙最大，对细胞的破坏最严重，进而引起了组织冰晶的进一步长大。不同冻结过程中冰晶总面积见图3，不同冻结过程中冰晶的面积、直径、圆度、拉伸度对比见图4。

由图4可知，未冻结的组织白色间隙面积范围为（119±8）μm2，相对直径范围为（12±1）μm，周长为（47±0.5）μm，圆度为 0.68，长度为 1.09。

图3 不同冻结过程中冰晶总面积（200倍）Fig.3 Total area of ice in different freezing（200 times）

图4 不同冻结过程中冰晶信息的对比Fig.4 The comparison of ice crystals information in different freezing processes

从以图4中可以看出图a，b，c有显著上升趋势，其变化趋势相近，呈显著相关。其中，-2℃时面积、直径、周长增长相对平缓，-6℃时其值急速增大，之后增长速度又相对减慢，但是比0℃到-2℃间的变化大。因此，可以看出明虾在不同冻结过程中-2℃到-6℃面积、直径、周长变化最大，此时明虾冻结通过最大冰晶生成带，冻结速率减慢，大量冰晶形成。而-6℃到-20℃期间已形成的冰晶吸附周围的未冻结水或水蒸气，使冰晶逐渐长大。另外，在3种冻结方式中超声辅助冻结增长趋势始终小于浸渍冻结，其次小于冰箱冻结，且超声冻结在整个冻结过程中形成更小面积更小周长的冰晶，对组织影响最小。超声冻结组织冰晶最终直径仅 46.81 μm，而浸渍冻结达 57.35 μm，冰箱冻结达67.58 μm，此结果与黄鸿兵[18]研究的猪肉冻藏后的冰晶直径在相似的范围内但略小。在-2℃到-6℃的过程中，冰箱和浸渍的圆度降低而超声的圆度相对呈增长趋势，这可能是超声冻结过程中超声作用导致大量晶核形成，而机械力对冰晶的圆度有一定破坏。在-6℃到-20℃的过程中超声冻结圆度平缓增长而冰箱和浸渍冻结圆度呈不规则变化。这可能与超声作用力对已形成冰晶的破坏有关。长度在冻结过程中，超声冻结在最大冰晶生成带结束前变化极小，之后急剧增大。浸渍冻结也有相同趋势，但是相对变化较小。而冰箱冻趋势变化平缓，在-2℃以后呈现平缓趋势，说明冰箱冻结过程中冰晶的长宽比受冰晶的增长影响不大。而超声冻结在大量冰晶形成后超声的空化作用及机械力对冰晶的破坏导致了冰晶长度的增加。超声辅助冻结组织优于浸渍和冰箱冻结，此研究结果与Xu等[19]研究研究的红心萝卜有类似结果。Islam等[20]也研究表明超声辅助冷冻蘑菇其形成的冰晶相对对照组更加细小。

2.3 冻结过程中中国对虾失水率与持水性变化

肌肉中的水分为结合水和自由水，占主要部分的自由水集中在结缔组织与肌原纤维之间的网络结构中，另一部分结合水存在于组织蛋白质结构、糖类的羧基、氨基、羟基等结构中使其相互间紧密结合。常采用失水性来衡量冷冻水产品组织水分的变化。组织中的水分流失直接影响着产品的质地、性状及品质。过多的汁液流失引起可溶性营养素、风味物质、重量的降低，导致组织结构变得干柴、多筋。失水性的增大也直接导致产品感官品质下降，促进组织内微生物的生长。冻结过程中，组织内的水分逐渐冻结成冰晶，小粒冰晶不断升华，数量减少，大粒冰晶变成更大的冰晶，这些冰晶长大，造成肌肉组织结构破坏，进而促使组织持水性下降[21]，不同冻结方式对解冻失水性的影响见图5。

由图5可知，随着冻结时间的延长，明虾的失水性逐渐增大，且超声冻结处理的明虾失水率明显较浸渍和冰箱冻结失水率同期值低。而冰箱冻结失水率增加最快，相比于浸渍、超声冻结失水性最大。冰箱失水性增大趋势明显大于超声冻结，这应该与冰箱冻结速度低于超声冻结有关。超声辅助冻结形成冰晶细小，对组织破坏较小，因此相应解冻失水性相对冰箱冻结较小。可能原因是普通冰箱冻结速度缓慢，生成的冰晶体较大，因而与空气接触的面积大，水分散失加快，从而导致其持水力值低。Kaale等[22-23]对三文鱼的研究也表明冻结速度越快，形成的冰晶越细小，失水性相对较小。胡亚芹等[24]在对带鱼的不同冻结方式中也得到相似结论。浸渍冻结相对传统冰箱冻结热交换快，能够促进温度平衡，达到组织快速结冰，形成较均一的冰晶。但是超声辅助冻结能进一步促进晶核的形成以及破碎已形成的冰晶，从而减少大冰晶对组织的机械损伤。

图5 不同冻结方式对解冻失水性的影响Fig.5 The effects of water loss in different freezing

持水性决定着冻品组织的状态，是判断食品性状的一个重要因素，其影响着水产品在贮藏运输过程中的质量变化、解冻后的汁液流失、烹饪时的重量变化以及肉的嫩度及多汁性。从而影响着产品的品质及经济效益。

持水性与质构特性密切相关，组织在贮藏过程中的持水性下降，引起肌丝晶格收缩，肌球蛋白变性，胞内间隙增加，不同冻结方式对持水性的影响见图6。

图6 不同冻结方式对持水性的影响Fig.6 The effects of water holding capacity in different freezing

从图6中可以看出，随着时间的延长，3种冻结处理的明虾持水性都依次降低，但是超声冻结持水性减小明显低于浸渍及冰箱冻结。冰箱冻结持水性在-20℃时下降最快，可能由于冰箱冻结相对超声冻结冰晶个体大，对组织损伤大，从而对细胞破坏更大，使持水性下降。与Kaale等[12，25]对三文鱼的研究有类似结果。冰晶形成直观影响着明虾肌体水分的迁移变化。

2.4 冻结过程中明虾水分变化与冰晶形态的相关性分析

将不同冻结处理过程中冰晶的相关指标与失水性进行pearson相关性分析，如表1所示。

表1 冻结过程中明虾失水性与冰晶形态的Pearson相关系数Table 1 The Pearson correlation coefficient of the water loss and the morphology of ice crystals of the penaeus chinensis in the freezing process

失水性与不同冻结过程中冰晶的面积、直径以及周长呈极显著相关，相关系数均在0.9以上。超声冻结与圆度呈显著相关性（p＜0.05），而冰晶的圆度和长度与失水性没有显著相关性。说明冰晶对组织的破坏主要取决于冰晶的面积、直径及周长，其中直径和周长对组织影响最大。

将不同冻结处理过程中冰晶的相关指标与持水性进行pearson相关性分析，如表2所示。

表2 冻结过程中明虾持水性与冰晶形态的Pearson相关系数Table 2 The Pearson correlation coefficient of the water holding capacity and the morphology of ice crystals of the penaeus chinensis in the freezing process

持水性与冰晶的面积、直径以及周长呈极显著正相关（p＜0.01），而除了超声冻结的圆度和长度与失水性有相关性外，其它冻结方式均没有显著相关性。

3 结论

在超声辅助、浸渍、冰箱3种不同冻结方式中，超声辅助冻结能最快通过最大冰晶生成带；冻结过程中的组织切片图可以看出超声辅助冻结过程中组织冰晶形成细小，组织的影响最小；冻结完成时，与浸渍或冰箱冻结相比，超声处理组持水性高7.19%～19.50%，失水性低1.30%～2.38%；明虾组织切片中冰晶面积直径、周长的变化趋势与解冻失水性、持水性变化呈极显著相关。因此，超声辅助冻结明虾可以有效提高冻结速率，减少水分变化，更好维持虾肉品质。为超声辅助冻结水产品提供了参考，在以后的研究中可以进一步探索超声冻结的其它优势。

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