β-氨基丙腈对SGC-7901细胞增殖、迁移和黏附功能的影响

崔雪萍，郭阳阳，史 琳，张 宁，韩 梅

赖氨酰氧化酶(LOX)是一种依赖铜的氨基氧化酶，在胶原和弹性蛋白由可溶性单体转变为不溶性纤维的过程中发挥着重要作用，参与细胞外基质的构建。现已发现肿瘤中LOX的表达改变使LOX可作为一个治疗靶点[1-3]。β-氨基丙腈(BAPN) 是LOX的不可逆性的抑制剂，其抑制作用呈剂量依赖性[4]。本文用BAPN抑制胃癌细胞SGC-7901的LOX活性，观察对其增殖、迁移和黏附功能的影响，为进一步了解LOX在胃癌转移中的作用及其机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料：SGC-7901来源于淋巴结转移的胃腺癌细胞，购自中国科学院上海生命科学研究所；培养基RPMI-1640购自Gibco公司；标准胎牛血清购自武汉三立公司；胰蛋白酶购自Amresco公司；MTT和 BAPN为Sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：SGC-7901复苏后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养。

1.2.2 四唑盐(MTT)比色实验绘制细胞增殖曲线：分别将对数生长期的SGC-7901细胞中加入含0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L和0.8 mmol/L BAPN的培养液中培养24 h，常规消化计数，取1.0×103个/孔细胞接种于96孔板中，每孔加入含上述浓度BAPN的培养液200 μl，每个浓度设4个复孔，放入孵箱中培养。此后每天相同时间点取出，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μl，37 ℃孵育4 h后终止培养，吸弃孔内上清，每孔加150 μl DMSO，混匀振荡10 min。在490 nm波长的酶联免疫检测仪上测定各孔光密度值，共检测7 d。以时间为横轴、光密度值(OD)为纵轴，绘制细胞增殖曲线。

1.2.3 同质黏附实验：将对数生长期的SGC-7901细胞分别用含0 mM、0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM BAPN的培养液预处理24 h，常规消化计数为105个/mL细胞悬液，分别加入板底已长满SGC-7901细胞的24孔板中，每孔200 μl(即每孔中接种细胞数为2×104个)，每个浓度设6个复孔，放入孵箱中培养60 min、90 min。吸出各孔上清液，生理盐水洗涤数次，光学显微镜下计数各孔上清液及洗涤液中的细胞数。同质黏附细胞数=2×104个-未黏附的细胞数。

1.2.4 异质黏附实验：SGC-7901细胞分别用含0 mM、0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM BAPN的培养液预处理24 h，常规消化计数为105个/mL细胞悬液，分别加入空的24孔板中，每孔200 μl(即每孔中接种细胞数为2×104个)，每个浓度设6个复孔，培养3 h。培养结束后，吸出各孔上清液，生理盐水洗涤数次，光学显微镜下计数各孔上清及洗涤液中的细胞数。异质黏附细胞数=2×104个-未黏附的细胞数。

1.2.5 体外划痕实验：分别将对数生长期的SGC-7901细胞中加入含0 mM、0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM BAPN的培养液中培养24 h。消化后以2×106个/mL细胞分别接种至6孔板，每孔1 mL，每个浓度设2个复孔。细胞汇合后用200 μl 的TIP枪头划痕，造成损伤模型，每孔加入2 mL含不同浓度BAPN的培养液。划痕后即在倒置显微镜下摄像，记为0时，此后分别在8、24、32、48 h 摄像，每个时间点随机取5个视野计算迁徙至损伤区的细胞数，以平均值评价SGC-7901在BAPN作用下的迁徙能力变化。

2 结果

2.1 BAPN抑制LOX对SGC-7901细胞增殖的影响:MTT比色法检测SGC-7901连续培养7 d的增殖情况。结果表明，加入0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM的BAPN，对SGC-7901细胞增殖无明显影响(P>0.05)；当加入0.4 mM和0.8 mM的BAPN，可明显抑制细胞的增殖(P<0.05)，见表1。

表1 MTT法检测不同浓度BAPN对MGC-7901细胞增殖的影响

2.2 BAPN对SGC-7901细胞同质黏附能力的影响:培养60 min和90 min后，SGC-7901对相同细胞的黏附结果见表2。当BAPN浓度为0.1 mM培养60 min时，对SGC-7901细胞的同质黏附无明显影响(P>0.05)；但培养90 min时，细胞的同质黏附能力增强(P<0.05)。当BAPN浓度为0.2 mM和0.3 mM时，两个时间点SGC-7901细胞同质黏附能力均增强(P<0.05)，见表2。

表2 不同浓度BAPN对SGC-7901同质黏附能力的影响(×103个

2.3 BAPN对SGC-7901细胞异质黏附能力的影响:SGC-7901经不同浓度的BAPN作用3 h后，加入0.1 mM BAPN对SGC-7901细胞在24孔板上的异质黏附能力无影响(F=286.405,P<0.05)；当BAPN浓度为0.2 mM和0.3 mM时SGC-7901异质黏附能力明显减弱(F=286.405,P<0.05)。

2.4 BAPN对SGC-7901细胞迁移能力的影响:与未加BAPN组相比，加入0.1 mM BAPN在24和32 h细胞迁移能力降低(P<0.05)；加入0.2 mM 和0.3 mM BAPN，在各个时间点的细胞迁移能力均降低(P<0.05)，见表3。

表3 不同浓度BAPN对SGC-7901迁移能力的影响(个，

3 讨论

转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，作用机制复杂，而肿瘤细胞的黏附能力在肿瘤侵袭与转移过程中发挥重要作用[5]。肿瘤转移时，肿瘤细胞需下调同质黏附而脱落下来，继而通过增强异质黏附锚定于毛细血管壁上，并穿透管壁逸出血管进入周围组织，或侵入基质，形成转移。

目前，已有多项关于LOX与恶性肿瘤发生发展关系的研究。LOX在肿瘤上皮细胞和被肿瘤侵袭器官的正常部分上皮细胞都是可以合成的，而且肿瘤上皮中高LOX水平和高格里森评分及肿瘤相关转移灶的诊断相关，正常上皮中高LOX水平与不良预后有相关性[6]。

大鼠前列腺癌细胞植入大鼠前列腺会导致LOX在肿瘤的表达增加且肿瘤有可能促进临近组织分泌LOX[7]。赵鹏等[8]发现，LOX在非小细胞肺癌发生发展的过程中可能通过表达量增高促进肺癌的发生和发展。在乳腺癌研究中，发现LOX的过量表达能够使得肿瘤细胞外基质结构发生改变，特定通路被激活，MMPs类表达水平上调，内皮细胞发生侵袭和迁移，新生血管出现，从而促进乳腺癌侵袭转移[9]。Wilgus ML等[10]研究肺癌患者发现，有癌细胞远处转移灶的患者比无远处转移患者的LOX表达水平有明显提高，认为LOX高表达可作为一个预后不良的独立指标。在乳腺癌、头颈部鳞癌的发展进程中，LOX促进肿瘤的迁徙转移[11]。最近的研究发现，在胰腺癌中LOX表现出预测标记的特性，并且在胰腺肿瘤小鼠模型中抑制LOX可以减少肿瘤转移[12]。而赖氨酰氧化酶样蛋白4(LOXL4)可以促进胃癌的增殖和转移，抑制LOXL4的表达可以抑制膀胱癌的肿瘤生长。

为了研究LOX对肿瘤细胞迁移和黏附功能的影响，我们用BAPN抑制LOX活性，观察胃癌细胞SGC-7901迁移、黏附能力的改变。首先通过MTT法检测BAPN对SGC-7901细胞增殖的影响，结果表明当BAPN在0.1～0.3 mM时对细胞增殖无影响，当BAPN浓度高于0.4 mM时细胞生长被明显抑制。为了避免抑制细胞增殖而影响后续实验结果，选择BAPN实验浓度为0.1～0.3 mM。

在同质黏附实验中，加入高于0.2 mM的BAPN后，细胞的同质黏附能力增加。异质黏附实验中，浓度高于0.2 mM的BAPN可下调肿瘤细胞的异质黏附。说明BAPN抑制LOX后，SGC-7901细胞加强了与同种细胞的黏附，不易从肿瘤上脱落下来，与基质和其他细胞组织的异质黏附的能力也减弱，其转移能力可能因此而下降。

本研究通过体外划痕实验发现，BAPN浓度增加至0.2 mM以上时，可抑制细胞的体外迁移能力。结果提示抑制LOX后，SGC-7901细胞的运动能力相应减弱，也不利于肿瘤转移。

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