不同产地白及组培苗生理特性和显微结构比较研究

李 翠， 张占江， 吴庆华， 蔡锦源， 黄骁强，，韦 莹， 王一诺， 韦坤华

（1.广西壮族自治区药用植物园，广西药用资源保护与遗传改良重点实验室， 南宁530023 2.广西壮族自治区药用植物园，中药材生产工程技术中心， 南宁530023；3.广西科技大学鹿山学院， 广西 柳州545000）

白及（Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.）又名连及草、甘根、冰球子、利知子、连及草、紫兰、紫蕙、百笠，为兰科白及属多年生草本植物，具有广泛的药用价值及园林价值［1］。中药白及其块茎主要用于补肺、消肿、生肌、止血、美白养颜，应对手足龟裂等。有关白及的报道多集中在化学成分、药理作用等方面［2］，白及的药用以及景观需求变得越来越大，而野生的白及资源在不断减少。近年，白及开始走组培苗工厂化生产路线，然而白及品质参差不齐，且白及的生理生态特性研究缺乏，白及进行驯化与人工栽培理论支撑不足，以致到现在人工栽培技术尚不成熟［3］。

探究白及体内可溶性总糖含量的多少以及过氧化物酶活性，是作为判断白及品质的一项指标［4］。结构决定功能，植物叶的主要功能是光合作用和蒸腾作用，叶是绿色高等植物合成有机物的重要器官。茎是运输养分的主要器官，根是吸收水分和矿物质的主要器官［5］。本研究旨在为筛选白及产业化优质种苗提供数据支持，通过石蜡切片法对白及组培苗解剖结构研究，结合可溶性糖和过氧化酶等生理指标考察，揭示白及组培苗的品质，为其开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为生长一致的武汉、合肥、重庆、杭州等4 个 不 同 产 地 的 白 及 （Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.）组培生根苗，选自广西壮族自治区药用植物园离体保存库。

1.2 方 法

1.2.1 白及丛生芽增殖

设计9组实验对4个产地白及进行扩繁，筛选试验以MS为基本培养基［1］，使用的植物激素与生长素为6－BA、KT和IAA，每个处理6瓶，每瓶接种5个外植体，选取的外植体大小长势接近，平铺于培养基表面，60d后测试管苗平均生长率。其中平均生长率的计算公式为：平均生长率（%）＝（30d后材料重－接种时材料重）／接种时材料重×100%。培养条件为光照强度1 500～2 000lx，光照时间12h／d，温度（25±2）℃。

1.2.2 可溶性总糖的测定

采用蒽酮比色法，精密吸取1mL已稀释的提取液于带塞试管中，在冰水浴条件下加入4.0mL，酮试长下测定吸光度值，以标准曲线绘制中1号管做为空白对照调零。平行做3组。并通过葡萄糖标准曲线查得待测样品提取液中可溶性总糖含量。计算方法：

可溶性总糖（%）＝［（C×V×n）／（a×w×106）］×100%

式中：C 为查标准曲线所得葡萄糖含量（μg）；V为提取液总体积（mL）；n为稀释倍数；a为测定体系中加入取提取液体积（mL）；w 为样品鲜重（g）；

该实验中，V＝50.00mL，n＝25，a＝1.00mL

1.2.3 过氧化物歧化酶测定

过氧化物酶活性的测定POD活性采用愈创木酚连续读数法测定，以每分钟D470变化0.01为1个酶活性单位（U）。

玻璃比色皿中加入3mL反应底物液和50μL 50mmol／L磷酸缓冲液（pH＝6.3）作为对照组调零。另一个玻璃比色皿中加入3mL反应底物液和50μL酶液，迅速将比色皿放入到紫外－可见分光光度计中，立即开启秒表记录时间，在470nm波长下测定吸光度值，每剂，沸水浴10min，冷却，取3mL待测液在620nm波隔20s记录读数1次，记录0～60s数据，平行做3组。

表1 正交试验因素水平组合

计算方法：以每分钟OD变化值（ΔA470／（g·min）表示酶活性大小。也可以用每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位（U）表示。

过氧化物酶活性（U／（g·min））＝ΔA470×VT／W×VS×0.01×t

式中：ΔA470为反应时间内OD变化值；VT为提取酶液总体积（mL）；W 为植物鲜重（g）；Vs为测定时取用酶液体积（mL）；t为反应时间（min）。

1.2.4 根、茎、叶解剖结构比较研究

石蜡切片法，以4个产地白及组培苗根、茎、叶为材料，剪取叶片中部含主脉1.0cm×0.5cm的长方形，根和茎剪取0.5～1.0cm长放入70%乙醇FAA固定液中固定24h。固定的材料经过梯度乙醇脱水、透明剂TO透明、梯度温度浸蜡、包埋、切片，切片厚度为10μm，番红固绿双重染色，并用加拿大中性树胶封片，每个样品重复3次，Leica DM 2000生物显微镜观察，并拍照。

2 结 果

2.1 不同产地白及组培苗扩繁培养

由表2可以看出，不同产地的白及组培苗在不同培养条件下，扩繁的平均生长率有所不同。培养60d后，4种白及在 MS＋6－BA 2.0ml／L＋NAA 0.35ml／L＋KT 0.2ml／L培养的平均生长率均达到最大，其中重庆产白及的平均生长率最高，为3.32%。

2.2 可溶性糖含量

由表3可知，武汉产白及的可溶性总糖含量为4.71%，杭州产白及的可溶性总糖含量为5.87%，重庆产白及的可溶性总糖含量为6.11%，合肥产白及的可溶性总糖含量为3.17%。重庆产白及的可溶性总糖含量最多。白及可溶性总糖含量越高说明白及的品质越好。

表3 白及可溶性总糖含量

2.3 过氧化物酶活性

由表4可知，过氧化物酶活性武汉产白及为1.7ΔA240／（g·min），合肥产白及为1.33ΔA240／（g·min），杭州产白及为1.30ΔA240／（g·min），重庆产白及为1.55ΔA240／（g·min）。可见，武汉产白及的酶活性最高。

表4 过氧化物酶活性变化

2.4 白及根、茎、叶显微结构对比分析如下

对4个产地白及组培苗营养器官解剖结构比较研究表明，由图2可看出，根、茎、叶数重庆产白及结构紧密，木质较好，材料较硬，重庆产白及茎，杭州产白及根、茎和叶片主脉发达，薄壁细胞分化完好，合肥产白及海绵组织发达。重庆产白及切片结构最佳。

合肥产白及组培苗叶主脉不发达，茎细胞由大到小整齐排列，而且结构紧密；合肥产白及根韧皮部较发达，保水性较好；重庆产白及叶主脉角质层较厚，栅栏组织较发达，细胞排列均匀，脉间距较小，海绵组织发育较好；重庆产白及茎木质纤维较硬，细胞排列紧致维管束较多；重庆产白及根、根毛较为发达，韧皮部与木质部发育良好。木质结构好，保水性强；武汉产白及叶主脉、栅栏组织不发达，角质层稍薄，上下表皮细胞排列均匀；武汉产白及茎细胞分化并不规整，而且纤维较弱维管束较少，木质较软；武汉产白及根、根毛发达，韧皮部较弱；杭州产白及叶主脉栅栏组织分化完整，维管束清晰，海绵组织发育较好；杭州产白及茎，细胞排列整齐，海绵体分化较好，但木质纤维较少；杭州产白及根、韧皮部发育良好。

3 讨 论

培养相同时间的4个产地白及组培苗酶活性和可溶性总糖含量差异各不相同，过氧化物酶含量差异不大，过氧化物酶是一种普遍存在于各种植物体内的酶，其活性与植物的代谢能力、抗病和抗寒能力有着一定的联系［6］，过氧化物酶差异不显著说明4个产地白及的抗性相近；但可溶性总糖含量差异显著，最低的武汉产白及的可溶性总糖含量为3.17%，最高的重庆产白及的可溶性总糖含量为6.11%，可溶性糖的差异，表明4个产地白及体内储存的碳水化合物能力差异很大，相同时间内，重庆产白及的储存量最高，几乎是武汉产白及的2倍，可溶性总糖是大多数植物的主要光合产物，并且也是碳水化合物代谢和暂时储藏的主要形式，其在植物体内还是一种重要的抗逆环境调节物质［7－8］。

图2 根、茎、叶横切结构

全球变暖背景下植物如何适应环境是当前生物学家所关注的重要科学问题。叶片是植物对环境变化反应最敏感的器官之一，其表型和显微结构具有较大的可塑性，它们的变化能集中体现植物对环境的适应性［9－10］。白及叶着生方向与地面近似垂直，叶片类型为等面叶。所以两侧受光情况差不多，叶肉中无栅栏组织和海绵组织的分化，或虽有分化，栅栏组织却分布在叶的两面，等面叶植物为适应环境条件，上下表皮细胞的吸收能力相近。4个产地白及叶肉中无栅栏组织和海绵组织的分化，主脉发达程度差异显著，重庆产白及和武汉产白及主脉显著木质化；重庆产白及、合肥产白及茎存在散生维管束，4个产地白及根均木质化，从程度上来说重庆产白及最显著，武汉产白及最弱，可能和各地海拔有关，合肥、武汉、杭州海拔接近，都在50m以下，重庆海拔偏高，250m左右。

综合生理指标和根、茎、叶解剖结构对比研究，4个产地白及组培苗过氧化物酶含量相近，重庆产白及可溶性糖含量最高，叶片主脉木质化程度高，茎维管束较多，根系发达，木质部和韧皮部分化细致，结构发达抗性好，可以作为工厂化生产进行推广，有待深入研究。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2015.

［2］李嵘，王拮之.白及的研究概述及其资源利用对策［J］.中草药，2006，37（11）：1 751，1 755.

［3］吴明开，刘海，沈志君，等.珍稀药用植物白及光合与蒸腾生理生态及抗旱特性［J］.生态学报，2013，33（18）：5 531－5 537.

［4］李芳兰，包维楷.植物叶片形态解剖结构对环境变化的响应与适应［J］.植物学报，2008（S 1）：118－127.

［5］吕洪乐，张同华，李倩.白及多糖药理作用的研究进展［J］.中国药房，2015（28）：4 014－4 016.

［6］蒋选利，李振岐，康振生.过氧化物酶与植物抗病性研究进展［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2001，29（6）：124－129.

［7］刘福强，王艳萍，韩丹，等.白及多糖的提取及其相对分子质量测定和结构研究［J］.中成药，2013，35（10）：2 291－2 293.

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［9］徐小林，郑兴峰，王荣华.露草营养器官解剖结构［J］.安徽农业科学，2015，43（27）：11－13.

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