大蒜绿色素前体物吡咯基氨基酸的成因研究

何贵山，王 燕，王赛元

(甘肃天然源生物科技有限公司，兰州 730050)

作为日常最佳保健食品之一，大蒜的营养和药用价值已被人们广泛认可，大蒜中不仅含有较高的蛋白质、脂肪、糖类，而且富含钙、铁、磷、硒、锗等矿物元素和多种维生素[1-2]。大蒜中氨基酸含量占粗蛋白含量的16%以上，尤其以精氨酸、谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸等最为丰富，其中精氨酸含量占氨基酸总量的20.4%[3-4]。

大蒜用途广泛，除鲜食外，还被经常加工成蒜汁饮料、蒜泥、蒜粉、脱水蒜片等制品。我国作为大蒜的主要生产国，大蒜已经成为河南、山东、河北等地部分区域农民增收的重要来源之一[5-7]。由于大蒜存在一定的休眠期，而且温度越低大蒜的休眠期越短，休眠期过后大蒜体内的绿色素前体物会逐渐增多，如果直接吃外观上可能没什么区别，但在工业化生产中一旦榨汁、捣泥，导致细胞破碎，大蒜体内积累的绿色素前体物和蒜氨酸酶一接触，使得大蒜汁迅速变绿[8-9]。绿变问题严重影响了大蒜的再加工和大蒜产业的进一步发展。现阶段已有众多学者对大蒜绿变反应的控制、绿色素的性质和合成途径做了大量研究。

1 吡咯基氨基酸对大蒜绿变的影响

Imai S等[10]为了证明吡咯基氨基酸对大蒜绿变有影响，在体外进行了模拟色素形成的实验研究，研究发现，用丙氨酸或缬氨酸与丙烯基硫代亚磺酸酯反应会生成吡咯基氨基酸，将吡咯基氨基酸再与烯丙基硫代亚磺酸酯反应生成蓝色色素。Wang D等[10]也做了体外合成吡咯基氨基酸的模型研究，所有模型实验合成的外源化合物吡咯基氨基酸加入蒜泥或着蒜汁中都可以使其发生不同程度的绿变，这些研究结果都证明吡咯基氨基酸及其化合物是大蒜绿色素形成的前体物，对大蒜绿变存在着重要影响[11]。

现阶段关于大蒜绿变机理的研究，学者们大都采用体外化学模拟的方法，通过大量的实验证实大蒜绿色素形成是吡咯环进一步聚合的结果，推测出吡咯基氨基酸是大蒜绿色素的前体物质，比如缬氨酸-吡咯[12-13]。研究者们发现，氨基酸的种类不同，其聚合后形成的色素也不一样，并且有的氨基酸聚合后不会形成色素，只有氨基和羰基游离的氨基酸才可以形成色素。在绿色素形成的过程中，氨基酸也是必须的，研究表明，大蒜绿色素的结构中含有一个吡咯环，但是单独的吡咯和氨基酸都不能使大蒜绿变，同时，吡咯基氨基酸作为色素前体物并不是绝对的，如吡咯基亮氨酸不能使蒜泥变绿，进而可知，大蒜绿色素对形成色素的前体物质结构上有着严格的要求[13-14]。

本文从大蒜绿变的反应过程入手，探讨了各种酶、S-丙烯基-L-半胱氨酸亚砜(PeCSO)、叶绿素前体物δ-氨基酮戊酸(δ-ALA)和胆色素原(PBG)的积累以及三羧酸循环对大蒜绿色素前体物—吡咯基氨基酸形成的影响，来控制蒜制品在加工中出现的绿变，为今后的有关研究提供理论参考与技术支撑，也对促进大蒜产业的发展具有重要意义。

2 大蒜绿变的反应过程

在大蒜绿变反应过程中，S-丙烯基-L-半胱氨酸亚砜(PeCSO)和S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜(ACSO)两种风味前体物质在蒜氨酸酶的作用下，分解为2-丙烯基次磺酸和2-烯丙基次磺酸，两种物质分别发生聚合反应，生成二丙烯基硫代亚磺酸酯和二烯丙基硫代亚磺酸酯(大蒜素)。其中，二丙烯基硫代亚磺酸酯与氨基和羰基游离的氨基酸反应生成吡咯基氨基酸。吡咯基氨基酸与大蒜素反应生成蓝色物质，但是由于蓝色物质不稳定，会缓慢分解为黄色物质，黄色物质和未分解的蓝色物质混合在一起，形成所看到的绿色物质，所以要从源头上抑制大蒜变绿，阻止或隔断吡咯基氨基酸的生成是一种行之有效的方法。

3 影响吡咯基氨基酸合成的因素

3.1 酶对吡咯基氨基酸的影响

3.1.1蒜氨酸酶 蒜氨酸酶存在于大多数的葱属植物中，是一种内源酶，其在大蒜中的含量约占水溶性蛋白的12%。蒜氨酸酶的最适反应温度为37℃，最适pH值为5～8，并且对底物有特异性要求[4，18]。从图1可以看出，在蒜氨酸酶的催化作用下，PeCSO先分解为2-丙烯基次磺酸，2-丙烯基次磺酸发生聚合反应，生成二丙烯基硫代亚磺酸酯。二丙烯基硫代亚磺酸酯和特定的氨基酸反应，生成色素前体物，即醚不溶性的吡咯基氨基酸。大蒜中自身存在的许多物质如半胱氨酸、氨基氧乙酸、氨基氧丙酸、盐酸羟胺、环丝氨酸等都可以起到抑制蒜氨酸酶活性的作用，进而抑制烯丙基硫代亚磺酸酯以及吡咯基氨基酸的生成，其中盐酸羟胺对酶产生的抑制作用为可逆的[4]。

3.1.2γ-谷氨酰转肽酶 γ-谷氨酰转肽酶在生物体内广泛分布存在。它由大小两个亚基构成，活性中心位于小亚基上[19]。该酶的最适温度比蒜氨酸酶的最适温度要高，为42℃，最适pH值为8.5[4，20]。储藏温度对该酶的基因表达影响较大，低温条件下，γ-谷氨酰转肽酶基因表达较强，合成速率也较快，当储藏温度大于20℃时，该酶的基因表达会受到明显的抑制。另外，大蒜具有一定的休眠期，通过测定不同休眠期大蒜中该酶的活性发现，在已打破休眠的大蒜中，γ-谷氨酰转肽酶的活性很高，而刚收获完不久正处于休眠期的大蒜中此酶的活性相对较低[20-21]。

由图1可以看出，在γ-谷氨酰转肽酶的催化作用下，大蒜中的某种γ-谷氨肽发生水解，促使后续反应得以进行。尽管该酶没有直接参与到绿色素前体物的生成过程，但却是生成吡咯基氨基酸所需成分必不可少的环节。因此可以推测，γ-谷氨酰转肽酶与吡咯基氨基酸的生成有着密切的关系。

图1 大蒜绿变的反应过程[15-17]

3.1.3催泪因子合成酶 来源于洋葱的催泪因子合成酶，对大蒜绿色素的前体物也有一定的影响。如图1所示，在大蒜绿变过程中，PeCSO在蒜氨酸酶的催化作用下先分解为2-丙烯基次磺酸，2-丙烯基次磺酸随即发生聚合反应，生成二丙烯基硫代亚磺酸脂，而此物质是生成吡咯基氨基酸的重要物质。Cho.J等[22-23]在试验中发现，当向上述反应体系中加入催泪因子合成酶时，由蒜氨酸酶催化生成的2-丙烯基次磺酸在该酶的催化作用下迅速分解为丙硫醛-S-氧化物，此物质与氨基酸反应生成的物质不形成色素，只有一小部分2-丙烯基次磺酸聚合形成酯类，但由于量小，与氨基酸反应也合成不了绿变前体物吡咯基氨基酸，故而不能产生绿变。

3.2 PeCSO对吡咯基氨基酸的影响

大蒜中S-烃基-L-半胱氨酸亚砜有四大类，含量最多的是ACSO，占到这四种成分总量的85%。其次是PeCSO，还有少量的S-甲基-L-半胱氨酸亚砜(MCSO)和S-丙基-L-半胱氨酸亚砜(PCSO)[17，24]。PeCSO容易受储藏温度的影响，当大蒜在低温下储藏时，随着时间的延长，PeCSO的含量也在逐渐增多。在大蒜未破碎以前，蒜氨酸酶和上述亚砜类化合物分别存在于细胞质和细胞的液泡中，当大蒜破碎、受损或者大蒜榨汁时，蒜氨酸酶就会释放出来和这些底物反应[4，25]。S-烃基-L-半胱氨酸亚砜在蒜氨酸酶的作用下，产生丙酮酸、氨以及次磺酸，次磺酸不稳定，通过聚合反应，缩合成硫代亚磺酸酯，硫代亚磺酸酯与氨基酸反应，形成色素的前体物—吡咯基氨基酸。

3.3 三羧酸循环对吡咯基氨基酸的影响

三羧酸循环是植物呼吸代谢重要途径之一，许多生物可以利用三羧酸循环的中间产物进一步反应生成吡咯类化合物[26]。在新鲜的大蒜中柠檬酸、α-酮戊二酸、延胡索酸含量较低。在发生绿变的大蒜中柠檬酸、α-酮戊二酸、延胡索酸含量均有所增加，促进了α-酮戊二酸经琥珀酰辅酶A形成吡咯类化合物的代谢途径(图2)。吡咯基化合物为大蒜绿色素提供吡咯结构，所以大蒜绿色素前体物的形成会受到三羧酸循环的影响[27]。

图2 三羧酸循环影响

3.4 合成叶绿素原料的积累对吡咯基氨基酸的影响

和红云等[28]对植物在低温储藏条件下叶绿素的含量变化进行了探讨，发现植物在低温下储藏，其叶绿素的含量明显低于高温下储藏的含量，且随着储藏温度的降低，该下降趋势愈加明显。但在低温条件下叶绿素的前体物δ-氨基酮戊酸(δ-ALA)和胆色素原(PBG)的积累量却明显比高温下储藏要高，这表明植物在低温储藏时，叶绿素的生物合成途径被阻断，从而使叶绿素的前体物δ-ALA和PBG的消耗减少，造成积累[29]。而PBG是四吡咯化合物的母体，可以使生物体显示一定的颜色，也是多种天然的四吡咯类色素合成的前体物质。而氨基酮戊酸(ALA)是经三羧酸循环的中间物琥珀酰CoA所引发的旁路系统中形成的，ALA在氨基酮戊酸脱水酶的作用下形成PBG[26]。低温贮藏时，大蒜中积累的ALA和PBG很有可能是作为中间物质参与了大蒜绿变色素前体物合成过程。

研究证实，叶绿素不是大蒜绿色素，因为大蒜绿色素的紫外吸收峰值与叶绿素的吸收峰值不一样[31]，但生物合成途径和叶绿素的生物合成途径存在相似之处。

4 结语

现有的研究结果表明，大蒜的绿变是一个多步反应，其中包括酶促反应与非酶促反应。本文从大蒜绿变的反应过程着手，讨论了各种酶、PeCSO、三羧酸循环和合成叶绿素原料的积累对大蒜绿色素前体物的影响。几种影响因素中除了催泪因子合成酶是外源加入外，其余均为大蒜体内本身存在或在反应过程中生成的，且几种因素都受到温度的影响，故可以根据每步反应的特点与要素以及相关的影响因素来寻找在大蒜加工过程中控制大蒜绿变前体物——吡咯基氨基酸的具体措施，进而控制大蒜绿变。◇

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