浅谈分子生物学在食品微生物检验中的应用和前景

□ 刘永嘉 单 非 阜新市检验检测认证中心

随着时代的发展，食品安全愈加被社会大众所关注，而与食品安全密切相关的食品检验就显得至关重要。分子生物学顾名思义，从分子水平研究生命本质，以微观视野分析生命现象。其中PCR技术在食品微生物检验领域具有不可取代的积极作用。

1 PCR技术的时代背景与意义

食品微生物检验的技术手段日益更新，常规检验方法不断优化（如各种显色培养基、生化鉴定试剂条等）[1]，酶联免疫法逐渐成熟[2]，分子生物学手段也没有缺席，理所当然地在食品检验领域成为热点。PCR是20世纪80年代中期开始发展的特定核酸体外扩增技术，至今PCR已经日趋成熟。可以说，在食品微生物检验领域PCR技术已经取得了显著的成绩，同时也存在着一些问题，使得这项技术没有被更普遍地使用，但这并不影响食品检验者对它的热情。因为对微生物本质核酸的探索，让食品微生物检验进入了另外一个层次，这也必将大大地推动食品微生物检验事业的进步。

2 传统PCR

2.1 传统PCR的原理

PCR的工作原理就是以目标核酸分子为模板，设计与模板核酸相匹配的单链核酸片段作为引物，在核酸聚合酶的作用下，按照半保留复制原则合成新的核酸。

2.2 传统PCR技术在食品微生物检验中的特点

用传统PCR法检测食品中金黄色葡萄球菌[3]、食品中沙门氏菌[4]等都取得了成功。样品悬液制备完成后，首先要进行核酸的提取，然后进行选择性扩增（PCR），最后进行凝胶电泳并观察记录。该方法对无菌环境和无菌操作没有太高的要求，可以对多个样品的目标菌同时进行检测，从而完成大批量的检测任务，具有很好的特异性、敏感性强，并且比常规方法更简单。

2.3 传统PCR技术应用于食品微生物检验时存在的问题

在食品微生物检验过程中，传统PCR法仍然存在假结果的可能。这是因为，一方面在样品中可能存在干扰因素或者抑制因素，以及聚合酶链反应效率差异很大，需要根据不同的因素设计优化反应条件，影响因素和反应条件的不同都会使得目标核酸的扩增不理想；另一个方面，在进行凝胶电泳准备工作时，人员操作的准确性、时效性对于结果有着显著的影响，增加了结果的不确定度。

3 荧光定量PCR

3.1 荧光定量PCR的原理

荧光定量PCR就是在反应体系中加入荧光因子监测荧光信号的变化过程，最后利用专业软件对目标核酸模板进行定量分析。

3.2 食品微生物检验中荧光定量PCR与传统PCR的比较

荧光定量PCR技术是在传统PCR方法的基础上发展出来的检验技术，在金黄色葡萄球菌[5]、芽孢杆菌[6]、大肠杆菌[7]等的食品微生物检验中都取得了成熟的经验。与传统PCR比较，该方法在结果读取分析上进行了改进，更简单、更快速、灵敏度更强。弥补了传统PCR 定性检测的一些不足，全过程采用闭管操作，用光谱技术代替凝胶电泳来呈现结果，减少了人员操作带来不利影响的机会，降低了扩增产物污染的可能性，有效地避免了假阳性结果的出现，同时对荧光信号累积过程进行监测分析，可以实现对样本中目标菌的定量检测[8]。但依然没有解决传统PCR在扩增过程中，放大干扰因素或者存在抑制因素的问题。

4 环介导恒温扩增技术

4.1 环介导恒温扩增技术的原理

环介导恒温扩增技术根据靶基因的6个区域设计4条引物，核酸链在某一恒温条件下达成解链和退火的动态平衡状态，因此可以在一个温度下完成核酸的扩增。

4.2 食品微生物检验中环介导恒温扩增法与荧光定量PCR法的比较

环介导恒温扩增是2000年由Notomi 等[9]发明的一种新式的恒温核酸扩增技术，目前已经在阪崎肠杆菌[10]、副溶血性弧菌[11]、金黄色葡萄球菌[12]等的食品微生物检测中取得不错的效果。荧光定量PCR法与环介导恒温扩增法都可以比较准确地检出目标菌，但相对于环介导恒温扩增法，荧光定量PCR法需要质量更高的核酸模板，需要更长的检测时间，需要更精密的仪器设备，相反环介导恒温扩增法用时短、成本低，环介导恒温扩增法更适合现场的快速监督抽检[13]。

5 讨论

PCR技术是分子生物学的重要手段，引入了光谱技术后，发展出荧光定量PCR方法，在结果收集分析阶段，以荧光信号为标的，有较好的特异性、敏感度。荧光定量PCR方法全程闭管操作，减少了与外界接触的机会，降低了实验室污染的可能性，这在操作程序上显得更优化、更科学。但相比常规检验方法，仍然存在仪器设备昂贵等问题。环介导恒温扩增另辟蹊径不同于常规PCR需要多个温度完成核酸的扩增，而是在恒温下达到核酸扩增的目的，用时更短、成本更低，同时依然有很好的特异性和敏感度。那么，将环介导恒温扩增法与荧光定量所用到的光谱技术结合起来，用环介导恒温扩增法进行核酸复制，在反应体系中加入荧光基团，然后监测荧光信号，进行分析得出结果[14]。这样就可以整合荧光定量PCR方法的优点和环介导恒温扩增法的长处，得到更加普遍使用的食品微生物检验分子生物学技术方法。

6 结语

荧光环介导恒温扩增法仍然还有很多地方需要完善，未来有很大的发展空间，是未来食品微生物检验应用分子生物学方法研究发展的方向，也势必会成为食品微生物检验领域至关重要的技术手段，为食品安全保驾护航。