猪流行性腹泻病毒血清学及临床诊断方法研究进展

雷喜梅，杨永乐，许姝雅，赵鹏伟，王斌，黄耀伟

（浙江大学动物科学学院动物预防医学研究所，杭州310058）

猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是冠状病毒科甲型冠状病毒属成员之一[1]。全日龄的猪均可感染PEDV，其中：哺乳仔猪会出现严重的腹泻、呕吐、脱水及较高的致死率，而较大日龄猪感染后临床症状较温和，死亡率较低[2-3]。1978年，PEDV在欧洲首次被发现并确定为猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）的致病因子[4]。1984年，我国确定存在PEDV。在1984—2010年间我国猪场虽存在PEDV感染，但并未发生大规模疫情[5]。自2010年末起，PED在南方几个养猪大省出现，随后全面爆发，给我国养猪业带来了巨大的经济损失[6]。

哺乳仔猪出现水样腹泻和高致死率是PEDV感染的最主要特点；但其他猪肠道冠状病毒，包括猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪丁型冠状病毒（porcine deltacoronavirus,PDCoV）及新发现的猪肠道甲型冠状病毒（swine enteric alphacoronavirus,SeACoV）也会引起相似的临床症状[7-9]。因此，对临床感染PEDV的准确诊断需要对PEDV特异性核酸或蛋白质进行检测，而不能仅依据临床症状和肠道病理变化。

传统的PEDV诊断方法主要依靠对病毒核酸、蛋白质或病毒特异性抗体进行检测。相比之下，虽然病毒学及聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法已能对PEDV感染作出准确诊断，但血清学方法可以对群体的免疫状态进行监测，从而为PED的防控提供更有价值的信息。

新生仔猪主要通过感染或免疫母猪的乳汁获得PEDV保护性抗体[10]。而乳液免疫主要依赖于肠道PEDV特异性IgA浆细胞迁移至乳腺，以及分泌性IgA（sIgA）在乳汁中的汇聚[11]。因此，对免疫后群体的抗体水平，尤其是母猪体内的抗体（病毒特异性IgG和IgA）水平，以及中和抗体水平进行监测至关重要。

本文对PEDV的血清学及诊断方法进行了综述，总结讨论了感染后抗体的动态，以期为PEDV快速检测方法的建立提供思路，为监测及评估群体免疫水平、优化防控策略提供参考。

1 PEDV编码蛋白及其功能

PEDV基因组含7个开放阅读框（ORF1a、ORF1b和ORF2～6）。其中，ORF1a和1b编码2个大的多聚蛋白（pp1a和pp1b），随后被病毒自身编码的蛋白酶切割成16个非结构蛋白（nsp1～16），参与病毒RNA的转录和复制[12-13]。ORF2～6编码4个结构蛋白，包括纤突糖蛋白（S蛋白）、膜蛋白（M蛋白）、包膜蛋白（E蛋白）和核蛋白（N蛋白）以及1个附属蛋白ORF3[12-14]。其中，S蛋白主要介导病毒与受体结合、细胞融合和病毒入侵，是诱导宿主产生抗PEDV中和抗体的主要靶标抗原[10]。因此，S蛋白常作为PEDV流行病学研究、分子诊断和血清学诊断的靶标抗原[15-16]；结构蛋白M和N也常用于PEDV分子诊断和血清学诊断试验[17]。

PEDV的S蛋白属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，由大约1 383个氨基酸组成（不同毒株有个别氨基酸插入或缺失），包括1个信号肽（1～18 aa）、一些中和抗原表位（499～638、748～755、764～771、1 368～1 374 aa）、1个跨膜区域和1个较短的细胞质区域[18]。根据冠状病毒S蛋白同源性可将PEDV的S蛋白划分为S1（1～789 aa）和S2（790～1 383 aa）2个亚单位[12]。对甲型和乙型冠状病毒S蛋白的电镜观察表明：S1蛋白作为受体结合单位有多个抗原表位区域[19-20]，其中包括4个主要的核心表位区域（S1A、S1B、S1C和S1D）；许多冠状病毒包括PEDV的S1蛋白N端还有1个S10区域。S1B区域是大多数冠状病毒受体结合域[19-20]。研究表明，PEDV S1B区域与氨基肽酶N（aminopeptidase N，APN）相互作用，利用APN作为其功能性受体[21-22]；但随后有报道对该结论表示质疑[23]。因此，APN是否为PEDV的功能性受体还有待进一步研究。

冠状病毒不仅与蛋白受体结合，而且与唾液酸类糖蛋白结合[24]。对于甲型冠状病毒TGEV，其唾液酸结合活性在S10区域。一些PEDV毒株的S1蛋白也有唾液酸结合活性和血凝活性，且主要定位在PEDV S10区域第246位氨基酸（246 aa）处[25]。不同PEDV毒株的S10区域有很大程度的遗传变异，包括区分S缺失株和非缺失株的插入和缺失[26-27]。S10区域的变异也可能是不同PEDV毒株之间唾液酸结合活性差异的原因。

病毒的受体结合区域通常是潜在的中和表位。研究表明，很多冠状病毒S1区域的中和抗体表位与受体结合区域重合[28]。针对PEDV的S1蛋白（499～638 aa）区域产生的多抗有一定的中和活性[29]。据报道，一个具有中和活性的抗PEDV单抗，其表位定位在PEDV的S蛋白390～789 aa处[30]。而在S1与S2结合处，鉴定出2个非中和性抗原表位[31]。LI等[11]鉴定出位于PEDV的S1亚单位上的6个无重叠的中和性和非中和性抗原表位，并证实中和性抗原表位可能主要定位在唾液酸结合区域（S10）或受体结合区域（S1B），进一步阐明了病毒表面细胞结合区域可能是潜在的中和区域。

PEDV的M蛋白作为一个跨膜结构糖蛋白，在病毒组装过程和补体依赖的病毒中和作用中发挥重要作用[32]。M蛋白和E蛋白共表达可以组装成假病毒颗粒，且该粒子与全病毒颗粒的抗原性基本一样[33]。鉴于M蛋白具有3次跨膜结构，对于其完整结构的研究较少。

PEDV的N蛋白与病毒RNA结合，为核衣壳形成提供结构基础，是与病毒基因组相关的最基本的磷酸化蛋白[34]。因此，N蛋白可以作为PEDV感染早期诊断的靶标。但N蛋白在不同猪肠道冠状病毒中相对保守，存在抗原交叉反应[35]，所以基于该蛋白的检测不能有效区分PEDV和其他猪肠道冠状病毒。

E蛋白作为冠状病毒小包膜糖蛋白，在不同冠状病毒中的功能有很大差异，且在病毒粒子的组装、病毒迁移、离子通道功能以及基因组表达方式等方面发挥的作用也都不尽相同[36-37]。当前基于PEDV E蛋白的血清学检测方法鲜有报道。

ORF3蛋白作为PEDV的唯一附属蛋白，可能对病毒毒力、细胞适应性等有影响[38]。高度细胞适应株与流行株之间ORF3的基因差异可以作为区分不同PEDV毒株的靶标[39]，但能否作为临床免疫应答检测指标尚属未知。

在PEDV非结构蛋白（non-structural protein,NSP）中，NSP3由多个结构域组成，包括N端的酸性区域（acidic domain,Ac）和1个高度保守的ADRP（ADP-ribose-1-phosphatase）多功能区域。Ac可能在病毒组装以及感染早期与核衣壳相互作用过程中发挥作用。ADRP则为冠状病毒基因组和亚基因组RNA的合成提供必要的辅助作用[40]。整体而言，当前对PEDV、PDCoV、TGEV等猪肠道冠状病毒编码的非结构蛋白，如NSP1、NSP2等的研究主要集中在免疫调控方面[41-43]，尚未对其血清学反应进行系统分析。

2 PEDV感染的宿主体液免疫应答

PEDV主要通过粪口途径传播，感染后6～14 d可在血清中检测到抗PEDV的特异性抗体[17]。THOMAS等[44]研究表明，抗PEDV的N蛋白和S蛋白的抗体反应并不相同：PEDV N蛋白特异性IgM在感染后7 d达到峰值，而S蛋白特异性IgM峰值出现在感染后14 d，此后一直下降至21 d；对于N、S蛋白特异性IgG，检出起点均为感染后7 d，前者的检测峰值为21 d，后者为14 d，两者均在感染后21 d开始下降，但N蛋白IgG一直维持到感染后43 d；对于N、S蛋白特异性IgA，S蛋白IgA消长动态与其IgG变化趋势类似，即在感染后7 d检出水平较低，14 d达到峰值，随后一直维持至感染后6个月。

总体而言：在感染猪血清中，对于IgM抗体，N蛋白先于S蛋白出现；特异性IgG出现时间相同，但S蛋白抗体更早到达峰值，维持时间较短；特异性IgA动态变化趋势与IgG相似。这表明，可以根据不同临床检测目的选择N蛋白或S蛋白作为PEDV感染不同阶段的诊断抗原。

CLEMENT等[45]对口腔分泌物中PEDV特异性IgG和IgA的检测表明：IgA占主要成分，且一直持续增长至感染后100 d；相比之下，IgG在14 d达到峰值，随后逐渐下降。PEDV中和性抗体（NAbs）在感染后7～14 d开始检出，在21 d达到峰值[44-46]。此外，NAbs能在感染后维持至少6个月[44-47]，与口腔分泌物中IgA的检测趋势相似，这可为PEDV感染后检测样品的选择提供重要参考。

3 PEDV特异性抗体的血清学诊断方法

PEDV主要在小肠中感染及复制，可出现短暂的病毒血症[48]。因其主要威胁新生仔猪，故PED的防控主要集中在如何提高新生仔猪黏膜免疫力，以及如何提高母乳中保护性抗体水平上。研究表明，母乳中PEDV的IgA水平与仔猪粪便中病毒RNA的排毒量呈线性关系，母乳中IgA水平高，则仔猪粪便排毒量显著下降[49]，证明IgA在乳液免疫和被动保护中发挥重要作用，同时也表明系统性抗体有助于仔猪抗PEDV感染。因此，对母猪乳汁和血清中抗体的检测均有助于对仔猪有效保护力的评估。

目前，血清学试验已成为评估PEDV感染后宿主抗体反应、群体免疫状态、疫苗及免疫策略有效性的重要方法。间接免疫荧光试验（indirect fluorescent antibody,IFA）、病毒中和试验（virus neutralization,VN）、酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）及荧光微珠免疫试验（fluorescent microsphere immunoassay,FMIA）均可用于感染动物的血清、初乳、乳汁、粪便及口腔分泌物中PEDV抗体的检测[16-17,50-51]。

3.1 间接免疫荧光试验

间接免疫荧光试验（IFA）常用来检测PEDV抗体，评估感染畜群的免疫状态[46-52]。通常将PEDV感染的Vero细胞培养物作为抗原对血清抗体进行检测。如果是阳性样本，则PEDV特异性抗体与固定在固相物上的抗原相结合，再用荧光标记的抗猪二抗放大信号，以倒置荧光显微镜进行观察。相比ELISA和荧光聚点中和试验（fluorescent focus neutralization,FFN），IFA费时少，易操作。

IFA也可用于PEDV特异性抗体的定量检测。测定抗体滴度时，将PEDV感染的细胞和连续倍比稀释的血清共同孵育，然后由特异性荧光信号所在的血清稀释度判定抗体效价。虽然IFA可作为急性感染阶段检测PEDV抗体的重要方法，但其敏感度较低，并不适合作为PEDV感染状况监测的最佳方法[46-52]。与ELISA方法相比，IFA终点滴度判读的主观性较大，容易出现人工误差。

3.2 病毒中和试验

病毒中和试验是通过中和抗体（NAbs）与病毒粒子的结合阻遏病毒复制周期中的一个或多个步骤，以降低病毒感染力为判定标准的检测方法[53]。如今已普遍用于PEDV特异性抗体的检测。

PAUDEL等[52-53]以致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）为依据检测了PEDV中和性单抗的中和效果。如病变不明显，则采用FFN来检测抗体[17,46]。其具体方法为：将连续稀释的血清和固定数量的PEDV抗原混合，孵育后感染Vero细胞，再用荧光标记的PEDV抗体来测定PEDV的感染力；以阴性对照为基准，将引起90%以上荧光消失的最高血清稀释度判定为中和滴度。由于在感染细胞中能更早检测到PEDV抗原，因此，以FFN检测中和抗体速度较快。

OKDA等[17]和JUNG等[46]利用FFN检测了PEDV试验感染后7～14 d的血清中和抗体，THOMAS等[44]和POONSUK等[47]用相似方法检测了自然感染6个月后的血清中和抗体，发现分娩4 d后母猪初乳中和抗体水平高于血清[17,46]。COLLIN等[54]、LIU等[55]、CHEN等[56]和LIN等[57]均基于VN或FFN对PEDV新型疫苗候选株进行了评估。由于中和抗体具有较高的专一性，SUN等[35]和GIMENEZLIROLA等[58]用VN区分了PEDV和TGEV诱导的抗体。经过优化的FFN试验可用于初乳和乳汁中PEDV中和抗体的定性或定量检测，是监测母猪乳汁中母源抗体的重要工具，但其主要不足仍在于中和抗体滴度终点判读的主观差异。

3.3 酶联免疫吸附试验

当前用于检测PEDV抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）主要包括间接法和竞争法2种。间接ELISA使用的抗原主要是全病毒或原核表达的重组病毒蛋白（S蛋白、N蛋白和M截短蛋白[59]）。竞争ELISA主要使用PEDV特异性单抗或多抗，其主要优势在于特异性，但不足之处是其主要依赖于竞争抗体的独特型及其针对靶抗原的特异性[59]。OKDA等[17]建立了几种检测PEDV抗体的血清学方法，包括基于PEDV的N蛋白间接ELISA和竞争ELISA。经试验和临床验证，该方法的敏感性和特异性均超过97%。2种ELISA方法都可检测感染后9～14 d的N蛋白特异性IgG，感染后43 d仍可捕获到较低水平的信号，足见其敏感性较强。POONSUK等[47]和LIN等[60]建立了可以评估口腔分泌物中PEDV特异性IgG和IgA的间接ELISA方法，结果发现口腔分泌物中特异性IgA持续增长至感染后100 d，表明采集口腔分泌物能较好地监测PEDV的感染状况。

3.4 荧光微珠免疫试验

荧光微珠免疫试验（FMIA）是将特定病毒抗原与免疫微珠结合，然后利用生物素-链亲和素荧光系统检测特异性抗体，再利用双重扫描设备以荧光强度指数判定结果。相比ELISA和FMIA，依据流式荧光微珠扫描系统能获得更高的分析敏感度、检测速率及通量。此外，还能对不同抗原产生的抗体进行检测。

OKDA等[17]建立了以PEDV的N蛋白为抗原的FMIA方法，用以检测血清中PEDV特异性抗体。该研究使用大量试验感染和临床感染样本，在感染后6 d及43 d均能检测到N蛋白的特异性抗体，其结果与间接ELISA、竞争ELISA及IFA结果有很高的相关性，敏感性和特异性均超过98%。虽然该试验仅采用N蛋白作为抗原，检测结果不太全面，但仍表明FMIA可作为未来血清学检测的重要工具。

3.5 不同PEDV血清学诊断方法小结

PEDV感染后的快速诊断是防控PED的有效措施，血清学检测是监测PEDV感染状况和评估疫苗接种有效性的有力工具。自2013年PED在美国爆发以来，针对PEDV的血清学诊断方法大量涌现，以期对PEDV不同毒株包括经典毒株、流行毒株及S缺失毒株的抗体进行鉴别诊断。特异性工具如PEDV结构蛋白S、N和M单抗，尤其是抗S1蛋白中和性单抗的研发[30]，必将有助于这些诊断方法的应用与完善。

基于本实验室制备得到的S蛋白特异性单抗、多抗及原核或真核表达的结构与非结构蛋白，笔者也正通过反向遗传学构建的表达绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白的重组PEDV病毒，逐步建立与完善可以有效鉴别与诊断PEDV经典毒株和流行毒株的检测方法。

4 小结与展望

PED在2010年后的爆发与PEDV变异株的出现有关[61]。虽然PEDV包膜蛋白M和核衣壳蛋白N也常用作血清学诊断的靶蛋白[17,62-63]，但其基因相对保守，不能准确反映PEDV流行株的临床感染情况。GIMENEZ-LIROLA等[58]分别用PEDV全病毒及重组蛋白S、M、N和E蛋白作为抗原对临床感染猪的792份血清样品中PEDV特异性抗体进行了ELISA检测，结果表明，以S1蛋白为抗原可以更好地反映临床感染后抗体动态规律。这与PEDV的变异及S基因重组相关的研究结果一致[60]。因此，当前亟须用更加准确、快速的诊断方法对PEDV的S基因变异情况加以监测。

PEDV的免疫监测困难，加上国内有效免疫监测方法的缺失，导致了疫苗接种与免疫监测的严重脱钩。当前商品化ELISA试剂盒的效果不佳，在实际生产中很难应用[63]。因此，有效疫苗与诊断试剂盒的研发是当前防控PED的重点之一。

新生仔猪对PEDV的免疫抗性主要由母源抗体提供，具有保护力的sIgA、IgG和IgM通过初乳和乳汁传给新生仔猪[64]。初乳中的IgG、sIgA主要由乳腺中抗体分泌细胞产生[9]。LANGEL等[9]对肠道-乳腺-sIgA抗体分泌轴进行了详细总结，结果表明，口服接种可以更有效地激活黏膜免疫系统，在黏膜和血液中产生保护性IgA，从而提高母猪和仔猪的免疫水平。基于这一原理，HOU等[65]于2007年通过试验发现，使用乳酸杆菌表达PEDV的N蛋白可针对性地刺激黏膜IgA和IgG产生。随后，LIN等[57]于2015年构建了可同时表达S1蛋白和N蛋白的重组乳酸杆菌疫苗，并证实该疫苗可诱导仔猪产生良好的免疫反应。随着基因工程技术的飞速发展，MENG等[66]利用真核表达载体构建了表达PEDV S蛋白的DNA疫苗，并证实该疫苗能有效激活细胞介导的免疫反应及诱导高水平抗体产生。2017年，HUANG等[67]构建了表达S基因的树突状细胞靶向性乳酸菌疫苗，经口服免疫小鼠后，可在其体内检测到高水平的PEDV IgG和sIgA，证明了该疫苗在小鼠动物模型中的有效性。

大力投入疫苗研发势必可为PED的防控提供有力的工具，但当前仍然缺乏评价这些基因工程疫苗免疫效力的动物模型，因此对免疫猪，尤其是母猪抗体动态的研究十分匮乏。此外，PEDV感染或免疫后保护性抗体与中和抗体、特异性sIgA、IgG之间的关系也尚缺乏翔实可信的研究报道。

最后，PEDV病毒的变异性，以及与多种肠道病毒的混合感染等变量因子导致PEDV感染的监测和防控更为困难。未来防控工作应主要着眼于PEDV流行株变异情况的跟进检测，以及对免疫动物应答水平动态变化的持续监控。

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