葡萄酒中潜在有害物质研究进展

魏晓峰，杨腊，UWAMAHORO Francoise，陈秋崇，李雨萌，房玉林*

（西北农林科技大学葡萄酒学院/陕西省葡萄与葡萄酒工程研究中心，陕西杨凌 712100）

作为一种营养丰富的低度发酵酒，除水和酒精以外，葡萄酒中还含有维生素、糖、有机酸等600余种物质[1-2]；此外，葡萄酒中存在的白藜芦醇等活性物质对人体健康具有诸多积极作用，可辅助消化、滋补养颜、杀菌、利尿、延缓衰老、预防血栓、清除活性氧、促进新陈代谢[3-4]。由于这些特殊功效以及人们消费理念的改变，葡萄酒正在迅速地被广大消费者所接受和认可。

在葡萄酒的各种功效被开发利用并受到消费者追捧的同时，其质量往往容易被忽视。葡萄酒的质量包括理化、感官和安全卫生几个方面，其中安全卫生是其必备基础[5]。原料、酵母、发酵和贮藏等条件都会影响葡萄酒的质量，而由于原料或生产环节等的影响，葡萄酒中可能存在生物胺、农药残留、甲醇、杂醇油、防腐剂及赭曲霉毒素等有害物质，过多摄入这些物质会对人体健康构成威胁[6-7]。目前对葡萄酒功能物质的开发利用[8]、葡萄酒营养与保健[9]、葡萄酒中单一有害物质的检验控制[10]常有报道，但关于葡萄酒中可能存在的有害物质的整体分析还很少见，故本文从形成原因、危害、限量、检测技术及控制方法等方面对葡萄酒中可能存在的有害物质进行了分析，旨在促进优质葡萄酒生产，提高消费者安全意识。

1 生物胺

生物胺（Biogenic amines,BA）具有活性，是一类低分子量的含氮有机化合物[6]，它的结构分为脂肪族、芳香族和杂环族3类。生物胺存在于各种动植物的组织中，奶酪、发酵香肠、啤酒、黄酒、葡萄酒等众多发酵食品中也普遍存在[11]。

1.1 生物胺的形成原因

食品中生物胺主要是由脱羧酶催化脱羧产生，或者是醛和酮通过氨基化和转胺作用产生。组氨酸可转化为组胺，赖氨酸可转化为尸胺，此外，酪氨酸、色氨酸、鸟氨酸、精氨酸等都是生物胺的主要前体物质。产生生物胺需要有足够的游离氨基酸，此外，还需要有具有氨基酸脱羧酶活性的微生物及适合微生物生长和脱羧反应的条件[12]。

1.2 生物胺的功能及毒性

微量生物胺是细胞中重要的活性成分，有助于促进生长和代谢、控制血压、消除自由基等；此外，生物胺还是合成荷尔蒙、核酸、蛋白质等的前体。但生物胺也是致癌物质的前体；过量摄入生物胺会导致头痛、恶心、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应，严重时甚至还会危及生命[11-13]。

组胺是研究最多、对人体影响最大的生物胺，欧盟规定其在鱼类产品中含量不能超过400 mg/kg。而对于葡萄酒而言，许多国家都对其组胺含量作出了严格规定（2～10 mg/L）[6,11-13]，对其他生物胺的限量标准还不够完善。

1.3 生物胺的影响因素

葡萄酒中生物胺含量受品种、气候、工艺、储存条件等因素影响。作为生长调节因子，若葡萄生长过程出现氮过量或者矿物质缺乏，生物胺的含量就会增加[6]；不同品种的葡萄中生物胺含量也不相同，比如在同等条件下，‘西拉’葡萄酒中腐胺、亚精胺和精胺的浓度均高于‘歌海娜’葡萄酒；而由于不同年份的气候条件和自然菌群差异，葡萄中的生物胺含量也会不同[12]。就生产过程而言，发酵过程中影响生物胺产生的因素主要是乳酸菌中氨基酸脱羧酶的活性；并且使用不同酵母菌发酵得到的葡萄酒生物胺含量也不同；苹果酸-乳酸发酵（MLF）之后，组胺、酪胺和腐胺的含量都会增加；酵母可以通过自溶效应释放氨基酸，所以如果发酵结束后酒和酒泥接触时间过长也会导致葡萄酒中生物胺含量升高[12,14]；此外，一般pH较高时，细菌繁殖较快，生物胺产生较多；此外，不同果胶酶种类、添加时间、添加量、发酵温度等都会对生物胺含量产生影响[15-16]。

1.4 生物胺的检测方法

生物胺缺少发色基团，其本身没有无紫外吸收和荧光电化学活性，所以其分离和测定都比较困难。电化学生物传感器测定生物胺简便快捷，但成本高，不能反复使用；毛细管电泳灵敏度高、分离速度快、成本低、易操作、污染小[12,14,17]，但也存在难分离等缺陷；离子色谱法分析时间较长，不适用于日常批量检测；HPLC具有分析速度快、柱效高、检测灵敏度高、定量分析准确的特点，已成为生物胺测定中的主要方法，但操作相对繁琐，衍生化时间长[13]；高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法准确灵敏且前处理简单，可尝试作为葡萄酒中生物胺筛选和确认的检测方法[18]。

1.5 生物胺的控制

根据生物胺的产生原因，首先应严格控制原料及商业发酵剂的质量，严格避免霉变、腐烂葡萄及生物胺菌株的污染[6,12,14]；其次，要接种优良的酵母菌株，添加活性干酵母可快速启动酒精发酵，同时能抑制野生酵母生长，从而控制生物胺的生成量；同时，MLF结束后应及时添加足够SO2来终止发酵，否则乳酸菌会继续将氨基酸脱羧产生生物胺，葡萄酒与酒泥接触时间过长也会增加生物胺的产生，在MFL后进行转罐、下胶、澄清等处理，并且在低温下贮存也有利于控制生物胺的产生量[6,13]；此外，葡萄酒中生物胺主要由乳酸菌对氨基酸脱羧而产生，故在实际生产中，可通过接种无氨基酸脱羧酶活性的菌株进行MLF，从而降低生物胺含量。

2 农药残留

农药残留是指由于不易分解，在施用后残留在土壤、作物以及环境中的一部分农药农残被人进食后在体内积累，引起中毒反应[19]。

2.1 农残的形成及危害

在葡萄的田间管理过程中，尤其在黄河故道、京津塘、环渤海等夏秋多雨产区，经常喷施大量的农药包括杀虫剂、杀菌剂和除草剂等来防治病害，这些农药首先进入葡萄果实中，然后通过发酵进入葡萄酒中。由于田间管理不规范和过量农药的使用，导致部分果实中农药残留量过高，这会影响酵母的正常生长代谢，延迟发酵，甚至产生一些不良代谢产物和异味物质，影响葡萄酒的感官质量[7,20]。这不仅给葡萄酒的质量安全带来了巨大隐患，阻碍了中国葡萄酒在世界贸易中的发展，更在一定程度上对人身健康产生潜在的威胁，同时这也是衡量社会管理水平和国家法制建设的一个重要方面[21]。

2.2 检测方法

目前葡萄酒中农药残留的检测方法很多，以色谱法为主。气相色谱法灵敏、效率高、速度快、选择性好，但不能准确测定热稳定性差的农药[20]；而相反，高效液相色谱法对于热稳定性差的农药更加适用，但其对检测器选择要求较高[19,22]；GC-MS分离效能高，且能够准确鉴定结构特点，可定性定量检测农药；LC-MS具有灵敏度高、选择性好、结果可靠等优点，但价格昂贵，目前在葡萄酒农残分析中的应用还较少[7,19]。

2.3 控制手段

葡萄酒中的农药残留来自于葡萄果实，所以必须从葡萄栽培管理开始着手，做到既要保证葡萄的正常生长，减小葡萄病害的发生，又要保证葡萄酒中的农药残留低于相应的标准[19,21]；同时，应致力于更优质农药和更有效检测手段的研究上，研发高效低毒农药[23]，开发多组分同时检测技术，样品制备实现微量、自动、无毒、快速和低成本化；相关部门也应尽早制定出更加严格、规范的标准及法规并切实有效地付诸实施；积极推行GMP和HACCP[24]认证，规范葡萄酒酿造工艺，建立葡萄酒安全性质量可追溯体系。

3 甲醇及杂醇油

甲醇（Methanol）对血管有麻痹作用及有导致神经变性的作用[25]，自酿葡萄酒由于发酵等条件控制不好，常会发生甲醇含量超标的情况，根据我国GB 15037—2006《葡萄酒》规定红葡萄酒中甲醇含量最高不得超过400 mg/L。杂醇油（Fusel Oil）是指高级醇的混合物，主要包括异丁醇和异戊醇[10]。

3.1 作用和危害

高级醇是葡萄酒的呈香物质之一，由蛋白质、氨基酸和糖类分解而成。适量高级醇能够使葡萄酒中的果香更加优雅、和谐，酒体更加丰满；但含量过高则会影响葡萄酒的风味和口感甚至人体健康；它能使人头痛、恶心、呕吐[26]。而甲醇含量高会引起失明等症状，甲醇含量是评判葡萄酒品质的重要指标[27]。

3.2 影响因素

酵母菌种及接种量不同，甲醇及杂醇油产量不同，发酵不完全会导致高级醇含量偏高；不同品种葡萄的总氮含量不同，氮含量不足会影响酵母合成代谢，产生较多的高级醇；发酵温度越高，加糖量越大，高级醇含量就越高[25]；而与分次分批加糖相比，一次性加糖生成的杂醇油稍高；添加果胶酶，有害物质甲醇及杂醇油均有增加，葡萄果胶含量越大，甲醇含量就越高[28]。

3.3 测定方法

目前常利用气相色谱技术对葡萄酒中的甲醇进行测定，该方法相对繁琐，耗时较长，且蒸馏过程中甲醇容易挥发损失[10]。而顶空气相色谱法处理简单、操作方便、检测时间短，但加入内标会导致时间延长、误差增大[26]；顶空气相色谱外标法则不需加内标，避免了内标法的缺点，被认为是一种较为简便、高效的测定葡萄酒甲醇的方法[29]。

3.4 控制方法

首先要加强葡萄栽培管理，提高其原料的内在品质；酿造时再选择合适酵母菌种及接种量的同时，要严格控制发酵温度、浸渍时间和加糖量，可以考虑结合冷浸渍发酵和桃红工艺；在酿酒辅料的使用中，对果胶酶的使用应根据不同活性的果胶酶进行测试，从而有效控制发酵中甲醇及杂醇油的产生；在贮存容器方面，采用橡木桶贮藏有利于葡萄酒中各类物质的缔合，同时有利于甲醇含量的降低[26-30]。

4 氨基甲酸乙酯

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）在工业生产中是重要的化工原料，可作农药、医药等有机合成的中间体，人的每日最大无毒剂量为0.3 ng/kg体重[31]。EC可能会诱发肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等疾病，并且高含量的乙醇可能对EC的致癌性具有促进作用，国际癌症机构（IARC）已将EC列为“2A”类致癌物，同时世界卫生组织又将其列为重点监控物质之一[32]。

4.1 合成途径

EC的合成途径有：焦碳酸二乙酯和氨反应、氨甲酰磷酸和乙醇反应、瓜氨酸和乙醇反应、氰酸和乙醇反应以及尿素和乙醇反应等5条途径。目前普遍认为，葡萄酒中EC的形成主要与两种前体物质有关，即尿素和瓜氨酸。尿素和瓜氨酸在葡萄汁和葡萄酒中的积累分别是葡萄酒酵母和葡萄酒苹果酸-乳酸菌（MLB）对葡萄汁中精氨酸代谢的结果。尿素、瓜氨酸和乙醇自发反应生成EC[31]。

4.2 影响因素

醇的反应是葡萄酒中形成EC的主要途径。葡萄酒发酵和贮藏过程中都存在形成EC的前体物质。作为EC形成前体物质之一的尿素一部分由葡萄原料带入，但绝大部分是由酵母菌代谢产生。若含量超标，在发酵、运输和贮藏过程中，尿素会与乙醇反应生成EC[33]；此外，酵母品种、原料同化氮及α-氨基酸含量、发酵条件等也会影响EC形成，加热可促进EC形成[34]。

4.3 检测方法

EC的提取和检测方法也在不断发展进步，经过柱前衍生之后，利用HPLC-FLD检测EC的方法准确度和精确度都很低，且检测结果不稳定，标准偏差较大；HPLC/MS方法精确度相对较高，但所需仪器昂贵，不适合大量样品检测；傅立叶变换红外光谱仪（FTIR）检测快速，但仅适合定性或半定量检；FUR方法的灵敏度和精密度较髙，但目前还不能满足酒精饮料限量精准的测定要求[35]。GC-MS法是目前最常用且分析效果最好的检测EC的方法，但萃取方法有差别，液-液萃取无需贵重仪器，但乳化现象严重，系统误差较大；固-液萃取法和固相萃取法准确度高，重现性好，但前者溶剂用量大；固相微萃取法虽简便快速环保，且不需萃取溶剂，是目前应用最多的方法[32]。

4.4 控制方法

控制EC，应适当降低发酵温度；防止发酵过程中污染杂菌（乳酸杆菌、乳酸球菌等）；适当选用尿素和精氨酸含量低的原料。选择合适的酵母菌和乳酸菌，微生物代谢精氨酸的能力越强，生成的尿素就越多，导致生成的EC就越多；另外，当酒中尿素含量过高时适量添加脲酶可以有效清除尿素，但要慎重考虑此操作对葡萄酒品质的影响[36-37]。

5 问题与展望

除以上所述外，实际生产中还存在众多安全隐患，如由于生态环境、农药肥料和酿酒设备等的影响而导致的重金属污染；葡萄种植、酿造过程中容易出现的赭曲霉毒素污染；防腐、防霉等食品添加剂的问题等，若不加注意，都可能对葡萄酒质量甚至人体安全构成威胁。而目前自酿葡萄酒的现象也越来越广泛，酿酒人员缺乏专业培训，纯手工操作也使成品稳定性得不到保证，此外，安全意识的缺乏也为自酿葡萄酒的安全埋下隐患。针对此现状，应从以下几点进行防治：

（1）重点提高葡萄原料质量，合理进行葡萄园选址、酿酒设备选择，正确适量使用农药；适时采收、严格筛选，从根源上减少安全隐患。

（2）建立健全葡萄酒质量安全追溯体系；加强葡萄酒质量检测技术方面的研究，建立健全葡萄酒标准体系和安全操作规范，不断改进酿酒工艺，提高酿酒技术水平。

（3）加大《食品安全法》宣传，贯彻实施力度，继续深入推进葡萄酒市场准入制度，建立一个长效的葡萄酒安全管理体制。重点建立葡萄及葡萄酒质量安全溯源体系，严厉打击制售假酒等违法犯罪行为，加强对重点消费环节的监管力度。

（4）加强安全知识普及，加强技术推广，使人们在享受自酿葡萄酒营养价值和饮用价值的同时，对自身的健康和安全负责。