青藤碱长循环脂质体的制备工艺研究*

霍仲坚，李婷婷，李木生，王 婴，王 岩（广东药科大学，广东广州510006）

青藤碱（sinomenine）是从防己科植物青藤或毛青藤的藤茎中提取的生物碱单体成分，临床常用于治疗各种风湿及类风湿性疾病[1-2]。最新研究发现，除具有镇痛抗炎、免疫作用外，青藤碱对各种恶性肿瘤细胞的增殖也具有较强的抑制作用，如肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌和宫颈癌等[3-6]。青藤碱具有作用靶点广、治疗效果好等优势。但由于其生物半衰期较短，临床治疗一般需长期大剂量给药才能使药效持续，剂量增大后在体内能促进组胺释放而致皮疹、粒细胞减少等严重的临床不良反应[7]。

长循环脂质体是在普通纳米脂质体的处方中，加入聚乙二醇（PEG）等亲水性物质修饰其表面，经静脉滴注进入体内后，由于极性增加，可延长其在循环系统的滞留时间，增加消除半衰期。除了可发挥一般纳米给药系统对网状内皮系统丰富的器官如肝、脾、肾的靶向性以外，还可起到缓释和降低毒性的作用。

本研究采用薄膜分散超声法制备青藤碱长循环脂质体，以包封率为指标，采用正交试验设计优化脂质体的制备工艺。

1材料与方法

1.1 材料 LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津）；Diamonsil C18色谱柱（250.0 mm×4.6 mm，5µm）；青藤碱对照品（中国药品生物制品检定研究院，批号：110774-200507）；卵磷脂（上海蓝季，批号：140729）；胆固醇（上海润捷，批号：20090203）；PEG2000（天津大茂，批号：20141206B）；PEG4000（天津福晨，批号：140125）；PEG6000（天津大茂，批号：150106）。

1.2 方法

1.2.1 含量测定方法的建立

1.2.1.1液相色谱条件 以十八烷基硅烷键合相硅胶为吸附剂，流动相为甲醇-水（25：75，用三乙胺调节pH至9.0），检测波长为262 nm，流速为0.9 mL/min，柱温为25℃，进样量为20µL。理论板数按青藤碱峰计算，不得低于2 000。

1.2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取青藤碱对照品11.2 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度为0.448 mg/mL的对照品溶液。

1.2.1.3 标准曲线的制备 分别精密量取上述青藤碱对照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成系列对照品溶液。精密吸取20µL，按上述色谱条件进样测定。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.1.4 精密度试验 精密吸取浓度为0.089 6 mg/mL的青藤碱对照品溶液20µL，按上述色谱条件连续测定6次，记录峰面积，计算RSD。

1.2.1.5 包封率测定 取底部开口的微柱离心管，填入SephadexG-50葡聚糖凝胶2g，加蒸馏水浸没，3000r/min离心5 min脱水，同法操作3次，使凝胶贴紧柱底部。精密量取青藤碱长循环脂质体乳液1 mL，加至柱床顶端，待样品溶液完全吸附后，加入pH7.2磷酸盐缓冲液5 mL，3 000 r/min离心15 min，收集洗脱液，转移至10 mL量瓶中，用无水乙醇定容，作为过柱后供试品溶液。另精密量取青藤碱长循环脂质体乳液1 mL，置10 mL量瓶中，加无水乙醇约9 mL，超声破乳至溶液变澄清，放冷，加无水乙醇至刻度，摇匀，作为过柱前供试品溶液。将上述两种供试品溶液分别注入液相色谱仪，记录峰面积，以过柱后与过柱前的峰面积比计算青藤碱的包封率[8]。

1.2.1.6 稳定性试验 精密吸取“1.2.1.5包封率测定项下”的同一份过柱前供试品溶液20µL，每隔2小时进样一次，记录峰面积，计算RSD。

1.2.1.7 重复性试验 取青藤碱长循环脂质体一批，按“1.2.1.5包封率测定项下”的方法平行制备6份过柱前供试品溶液，精密吸取20µL进样测定，计算RSD。

1.2.1.8 加样回收率试验 取已知含量的青藤碱长循环脂质体一批，按1∶1比例加入青藤碱对照品溶液，余按照“1.2.1.5包封率测定项下”的方法操作，测定过柱前脂质体中青藤碱的含量，计算回收率。

1.2.2 制备工艺优选

1.2.2.1 单因素试验 按处方称取青藤碱5 mg、胆固醇10 mg、大豆卵磷脂40 mg，置50 mL茄形瓶中，加入25 mL无水乙醇溶解，在50℃下旋转蒸发使其形成一层均匀薄膜，备用。另取PEG2000、PEG4000及PEG6000各2.5 mg，加入pH7.2磷酸盐缓冲液10 mL使溶解，制成分散相。将分散相溶液加至茄形瓶中，振摇使薄膜脱落并均匀分散，转移至具塞锥形瓶中，超声处理30 min，用0.45µm微孔滤膜滤过。精密量取1 mL，按照“1.2.1.5包封率测定项下”的方法操作，测定包封率。

1.2.2.2 正交试验设计 在预实验及参考文献的基础上，采用L16（4）5正交表设计实验方案[9-11]，以包封率为指标，筛选药脂比（青藤碱∶卵磷脂）、胆脂比（胆固醇∶卵磷脂）、PEG6000含量（%，处方总占比）、超声时间（min）等四因素的适宜条件。因素水平见表1。

表1 因素水平表

1.3 统计学处理 采用正交设计助手Ⅱ3.1对实验结果进行极差和方差分析。首先根据各因素不同水平包封率均值的极差大小确定因素的主次顺序。同时以误差为参比，根据离均差平方和对实验结果进行方差分析和显著性检验，得出优选工艺。

2 结 果

2.1 含量测定方法学考察结果 青藤碱对照品峰面积对进样量的回归方程为Y=310 641X-29 013，r=0.999 1，青藤碱在0.448～4.480µg内呈良好的线性关系。精密度测定峰面积的RSD为1.69%，表明仪器测定具有良好的精确性。稳定性试验结果8 h内峰面积的RSD为2.56%，10 h后RSD则大于3.00%，峰面积逐渐呈下降趋势，表明供试品溶液可在8 h内保持稳定。重复性试验结果测得青藤碱含量的RSD为1.99%，结果表明本法具有良好的重复性。6批样品的平均回收率为95.72%，RSD为2.69%，结果表明本法具有良好的准确度。

2.2 制备工艺优选结果 以PEG2000、PEG4000及PEG6000制得脂质体的包封率分别为50.5%、46.7%、52.1%。结果表明，以PEG6000为表面修饰剂时包封率最高。

正交试验结果及直观分析结果见表2，方差分析结果见表3。由极差的大小排序可知，对青藤碱包封率影响最大的因素是药脂比，影响最小的为PEG6000含量；方差分析结果表明，药脂比与胆脂比对实验结果影响显著，而PEG6000含量与超声时间对实验结果影响不大。青藤碱长循环脂质体的制备条件最终确定为A3B3C1D1，即药脂比为 1∶8，胆脂比为 1∶3，PEG6000 含量为0.25%，超声时间为15 min。按优选工艺进行验证试验3批，测得包封率为61.25%、60.17%、62.33%，表明工艺稳定可行。

表2 正交试验及直观分析结果

表3 方差分析结果

3 讨 论

脂质体的包封率测定方法有微柱离心法、透析法、凝胶过滤法等[12]。预实验时曾对上述方法进行了比较研究，结果三种方法测得包封率的平均值差异不大，但微柱离心法较透析法、凝胶过滤法具有更好的稳定性和重复性。

在长循环脂质体中，表面修饰剂的种类和用量主要影响脂质体的包封率和给药系统在体内的循环时间。单因素实验结果表明，采用不同相对分子质量的PEG制成脂质体的包封率差异较大，以PEG6000的结果最佳。正交试验结果表明，PEG6000的处方用量对脂质体的包封率无明显影响，本实验暂定其用量为处方量的0.25%，该比例尚需在动物体内的药动学研究中进一步确定。

正交试验结果表明，PEG6000的处方用量对脂质体的包封率无明显影响，因而暂定其用量为正交设计的最小用量。

本研究采用正交试验法对青藤碱长循环脂质体的制备工艺进行了工艺优化。所得工艺操作简便，重复性好，包封率高。但由于制备工艺研究中仅以包封率为指标，无法体现优选工艺的体内长循环效果，故该工艺尚需通过动物体内的药动学研究进行验证。

[1]孙越华，朱清，李俊旭.青藤碱抗炎免疫与抗肿瘤作用研究新进展[J].中国药理学通报，2015，31（8）：1040-1043.

[2]王昊，刘天盛，陈旭义．青藤碱对胶原诱导性关节炎大鼠治疗作用[J]．中华实用诊断与治疗杂志，2015，29（6）：535-537．

[3]张洪长，刘明昕，张莹，等.青藤碱对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞 MyD88、TRAF-6 表达的影响[J].中国免疫学杂志，2015，31（4）：485-489.

[4]陈伟毅，秦春宏，银晓刚.青藤碱抗肿瘤作用研究进展[J].中国药师，2013，16（12）：1902-1904.

[5]LI XJ，YUE PY，HA WY，et al.Effect of sinomenine on gene expression of the IL-1 beta-activated human synovial sarcoma[J].Life Sci，2006，79（7）：665-673.

[6]JIANG T，ZHOU L，ZHANG W，et al.Effects of sinomenine on proliferation and apoptosis in human lung cancer cell line NCI-H460 in vitro[J].Mol Med Rep，2011，3（1）：51-56.

[7]王晓洁，牛剑明，徐丽丹，等．青藤碱抑制肺癌细胞株Calu-1增殖、凋亡影响的实验研究[J]．现代肿瘤医学，2013，21（2）：267-270．

[8]王华洋，李岩，魏海，等．青藤碱制剂与药代动力学研究进展[J]．上海中医药杂志，2010，44（10）：84-89．

[9]赖滢滢，王岩，张英丰．星点设计-效应面法进行蛇床子素脂质体处方优化的研究[J]．中国新药杂志，2015，24（6）：708-712．

[10]王俊，王芳.龙眼核中原花青素的提取工艺研究[J].现代医药卫生，2016，32（5）：660-662.

[11]魏彩彩，李雪利，郝磊，等.正交试验优化余甘子配方颗粒的提取工艺研究[J].中国药房，2017，28（1）：61-63.

[12]宾妹，王岩，王婴.齐墩果酸脂质体的制备工艺研究[J].广东化工，2015，42（13）：18-19.