长链非编码RNA参与结直肠癌转移途径的相关研究

王晴美，谢亚莉，陈 婷，曾元清，罗迪贤，3

(1南华大学附属郴州市第一人民医院检验病理医学中心,2南华大学转化医学研究所,3南方医科大学附属郴州市第一人民医院,湖南郴州423000)

0 引言

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化道中常见的恶性肿瘤之一,发病率居全球恶性肿瘤第三位,目前仍是全世界范围内对健康关注的热点。虽然CRC的诊断和治疗在不断进展,但每年记录有超过120万新的CRC病例和60多万死亡病例［1］。CRC的发生除了与遗传、年龄、环境因素密切相关外,还与不良饮食习惯、肥胖及吸烟等因素有关,具体发病机制尚不清楚。CRC的预后主要取决于早期诊断和及时手术治疗,癌肿只局限于肠壁者预后较好,癌瘤浸润广泛、有远处转移者预后不良［2］。转移的形成是肿瘤细胞从原发性肿瘤微环境传播到各种远端器官和向其他部位殖民化的过程。虽然由于肿瘤早期筛查的普及与治疗的不断改善,近十年来CRC患者的死亡率呈下降趋势,但侵袭、转移仍是引起CRC患者临床疗效低和生存期短、预后差的关键因素［3］。因此,我们有必要揭示CRC转移过程的基础认知。此外与肿瘤转移途径相关的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、血管生成、细胞逃逸、癌细胞侵袭等对于转移性生长是必不可少的［4］,所有这些步骤对于我们了解转移期间的生物学过程至关重要。

在人类中估计至少有90%的基因组被转录,但只有2%被翻译成蛋白质,非编码基因远多于编码基因。非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)主要包括小非编码基因(如microRNA分子等)及长链非编码基因(lncRNA)。近期的研究［5］显示ncRNA在不同疾病中异常表达,参与多种生物学功能。且大部分ncRNA都具有基本的管家功能,如参与mRNA翻译的核糖体RNA(rRNA)和转运RNA,参与剪接的小核RNA和参与rRNA修饰的小核仁RNA。在这些非编码基因中,lncRNA正在成为一类癌症发生发展不可或缺的参与者［6］。此外,在 CRC中也发现了一些lncRNA的异常表达,并对CRC的侵袭与转移起重要的调控作用［2］。由于lncRNA的肿瘤或组织特异性表达模式,其在CRC中的异常表达与转移途径之间的关联亟需进一步研究探索。就目前来看研究数据仍有限,基于 lncRNA的研究进展,有必要总结lncRNA在肿瘤转移中的相关性研究,特别是在CRC中。

1 长链非编码RNA的概述

1.1 长链非编码RNA的概念文献［7］报道,除了蛋白编码基因能够调节肿瘤侵袭转移外,也存在一些非编码基因参与肿瘤的侵袭转移过程。非编码RNA主要包括小非编码RNA及长链非编码RNA。LncRNA是指长度大于200 nt,缺少开放阅读框并且不具备蛋白编码功能的转录本,其紊乱与多种疾病相关［8］。LncRNA在多种恶性肿瘤中异常表达与肿瘤的发生发展直接相关,并且lncRNA已经成为影响转录以及其他表观遗传调控网络的重要组成部分。

1.2 长链非编码RNA的来源与分类LncRNA主要来源有五个方面:由编码基因结构的中断产生；染色质重组产生；复制子串联产生；非编码基因反转录产生；编码基因中插入转座子转录产生。根据lncRNA相对于相邻蛋白编码基因的位置,可分为正义型、反义型、双向型、基因内型、基因间型。这使lncRNA的表达具有时空特异性和组织特异性。

1.3 长链非编码RNA的作用机制LncRNA与一系列生物过程有关,包括染色质修饰、转录干扰、选择性剪接、编辑、翻译起始和miRNA衰变。LncRNA的核心功能是能够作为DNA、RNA和蛋白质靶标的支架或作为募集、隔离效应蛋白的诱饵。最近的研究［6］揭示了lncRNA通过与蛋白质、RNA和脂质相互作用在癌症发生发展中起关键介质作用。其中lncRNA在生物学功能中的作用机制主要可归纳为以下几点:可通过与编码蛋白基因的mRNA互补结合形成双链结构,进而干扰mRNA的剪切,形成不同的剪切形式；或在核糖核酸内切酶的作用下产生内源性siRNA；可直接与蛋白质结合调节其结构活性或者改变蛋白定位；通过在编码蛋白基因的上游启动子区转录,进而干扰下游基因的表达；通过抑制RNA聚合酶Ⅱ或染色质重塑影响下游基因的表达；可与蛋白质形成核酸蛋白质复合体,形成经典的lncRNA-蛋白作用模式；还可以作为竞争内源性RNA(ceRNA)调控基因表达等［9］。此外,lncRNA在不同的癌症,如肝细胞癌、胃癌和非小细胞肺癌中的异常表达与癌症转移高度相关［10］。例如,转移相关的肺腺癌转录本1(MALAT1)被发现在乳腺癌和其他癌症类型中表达失调,并与早期转移预测和生存预后相关。MALAT1主要是通过调节前体mRNA的加工影响基因表达。部分lncRNA在癌症中可通过调节p53、NF-κB等重要的转录因子来进行转录调控。目前关于lncRNA研究最多的另一个例子是HOX转录本反义RNA(HOTAIR),HOTAIR能够通过与PRC2直接作用将PRC2重新定向到特定的基因组位点,调控一组特定的基因,从而调控癌症的侵袭和转移［11］。

2 长链非编码RNA调控结直肠癌的转移

癌症的发生是一个复杂多步骤的过程,转移癌是指肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管,血管或其他途经被带到它处继续生长,形成与原发部位肿瘤相同类型的肿瘤,这个过程称为转移。转移是恶性肿瘤的特征,肿瘤细胞同质型粘附降低,从原发灶脱离；与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)发生异质型粘附增加；ECM降解,形成肿瘤细胞移动通道,并以此为诱导血管生成的基础；肿瘤细胞运动性增强在粘附降解的过程中移动,穿透ECM,并穿透血管壁的基底膜进入循环；在循环中逃避免疫系统识别与破坏；到达继发部位后,在有新生血管形成的前提下增殖,形成转移灶。所有这些肿瘤细胞转移的步骤对于我们了解转移期间的生物学过程至关重要。许多与转移相关的途径包括EMT、血管生成、细胞逃逸、侵袭等是转移形成的关键［12］。因此,我们在下面详细论述了不同lncRNAs和这些转移途径在CRC中的关联,并支持lncRNA作为CRC防治的潜在目标。

2.1 EMT途径EMT是将粘附上皮细胞转化成可侵入细胞外基质的个体迁移细胞的事件,在机体的初步形成、多个组织和器官的分化中起关键调控作用,它可以通过各种机制引起器官纤维化并促进癌症进展。EMT被认为是肿瘤转移的关键因素［13］。有研究［14］已经证明EMT是原发肿瘤细胞获得迁移能力和转移的潜在驱动力之一。EMT也与肿瘤细胞侵袭性及干细胞样表型相关,据报道［3,12］大量的lncRNA通过调节EMT进展影响CRC的肝转移。

随着转录组学分析技术的进步,研究［15］报道了CRC中差异表达的lncRNA通过调控EMT途径参与转移。锌指E-盒结合蛋白1(ZEB1)的过表达可促进波形蛋白与N-钙粘蛋白转录,同时抑制E-钙粘蛋白转录,从而激活EMT途径。在CRC干细胞中高度表达的HOTAIR调节EMT相关分子E-钙粘蛋白、波形蛋白和N-钙粘蛋白的表达失调［16］。H19被证明是CRC细胞中EMT的一种新型调节因子。研究［17］发现H19作为miR-138和miR-200a的ceRNA参与EMT的多个基因表达的调控,干扰H19的表达后能明显抑制CRC细胞中间充质核心标记基因波形蛋白、ZEB1和 ZEB2的表达。 Guo等［18］发现 BRAF激活的lncRNA BANCR在CRC淋巴结转移组织中表达上调,进一步细胞实验证明BANCR通过MEK/细胞外信号调节激酶依赖机制诱导EMT进展。此外,牛磺酸上调基因1(TUG1)在CRC中过表达并通过激活EMT相关基因的表达来促进细胞迁移［19］。由转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)激活的lncRNA-ATB促进肝细胞癌的侵袭转移级联,并在CRC转移癌组织中高表达。进一步机制研究［20］证明,lncRNA-ATB通过阻断miR-200a下调上皮标志物(E-钙粘蛋白,ZO-1)的表达,同时增加间充质标记物(ZEB1和N-钙粘蛋白)的表达来促进EMT表型。此外,CHEF可通过Twist1/EMT信号通路诱导miR-489的缺失促进CRC的转移［21］。此外,CHRF的过表达与CRC组织中miR-489的表达呈负相关。研究［21］证据已证明CHRF诱导的miR-489损失可能通过TWIST1/EMT信号通路促进CRC细胞的转移和EMT过程。ZFAS1在CRC中的表达与肿瘤的TNM分期、血管侵犯和淋巴结转移显著正相关,研究［22］证明ZFAS1是通过调节ZEB1表达来诱导EMT的癌基因。CTD903在CRC组织中的表达与淋巴转移和远处转移相关,进一步的机制研究［23］证明CTD903通过抑制Wnt/β-catenin信号通路引起Twist和Snail的表达下调。研究［24］发现PANDAR在CRC中的表达与ZEB1的表达呈正相关,在PANDAR高表达的细胞中干扰ZEB1的表达能够显著降低细胞迁移和侵袭能力,PANDAR还可以通过抑制N-钙粘蛋白、波形蛋白、β-连环蛋白、Snail和 Twist表达,同时增加 E-钙粘蛋白的表达水平来影响EMT,促进CRC转移［24］。新发现的lnc-GNAT1-1在CRC组织和血浆中低表达,体外实验［25］证明,上调 lnc-GNAT1-1的表达后通过调控RKIP-NF-κB-Snail信号通路抑制CRC细胞肝转移。LINC01133和SLC25A25-AS1在CRC中被确定为肿瘤抑制因子。LINC01133通过与SRSF6相互作用抑制CRC的EMT［26］。 SLC25A25-AS1下调后促进CRC的EMT过程依赖于ERK和p38信号通路［27〛。因此,越来越多的lncRNA被证实通过作用于EMT途径促进或抑制CRC的转移。关于这些lncRNA作为CRC的致癌或抑癌基因,有望成为未来CRC的新型诊断、预后指标和基因治疗的潜在目标。

2.2 血管生成途径血管生成是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉的新毛细血管的生长。血管生成一般包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道形成血管环和形成新的基底膜等步骤。由于肿瘤组织的新生血管结构及功能异常,且血管基质不完善,因此肿瘤细胞不需经过复杂的侵袭过程而直接穿透到血管内进入血流,并在远隔部位形成转移。研究［28］证明,肿瘤进展是肿瘤细胞从血管前期到血管期的发展。例如类似CRC的实体瘤需要有血管发生才能长到超过2 mm的大小。肿瘤血管生成需由肿瘤微环境内的促血管生成因子(VEGF/VEGFR、PDGF/PDGFR)和抗血管生成因子(TSP-1/TSP-2)之间的复杂相互作用驱动。与血管周期性肿瘤相比,血管化肿瘤诱导血管发生,体积更大,具有转移倾向［26］。因此,涉及血管生成的细胞信号通路已成为研究的热点。血管生成是肿瘤转移和生长的标志［29］,这也与CRC的晚期肿瘤生长和远处转移有密切相关。

累积证据［28］证明在基因组中已经鉴定了ncRNA在血管生成中具有调节作用,例如lncRNA在肿瘤的血管生成中起关键作用。据报道［30］,MALAT1被证明在体外和体内促进血管生成,沉默MALAT1的表达后可诱导结直肠内皮细胞的早期反应,增加基础发芽和细胞迁移,并抑制内皮细胞增殖。此外,在小鼠模型中MALAT1可调节血管密度、血管扩张和血流恢复,进而激活血管发生［31］。因此,这一系列的研究表明MALAT1在血管生成中起关键作用。随后,与肝细胞癌中微血管侵袭相关的MVIH也被证明通过抑制血管生成至关重要的磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1,PGK1)的分泌来激活血管生成促进肿瘤生长和肝内转移［32］。 有研究［3］发现,小鼠中缺失 MEG3 基因导致围产期致死,并与血管生成增强有关。由于MEG3与血管生成相关的VEGF水平呈负相关［33］,MEG3很可能通过影响VEGF的表达来调节血管生成。在大肠癌小鼠模型中,下调ANRIL可抑制肿瘤的生长、大小、淋巴结和淋巴管的转移率,同时降低VEGFR-C、VEGFR-3 和 LYVE-1 的表达［34］。 近来研究［35－38］发现 HOTAIR、 MALAT1、H19、 TUG1 和 lincRNA-p21等不同的lncRNA被证明参与不同癌症的血管生成,有趣的是,以上这些lncRNA被证明参与CRC转移,它们可能部分通过调节血管发生来影响CRC的转移。所有这些证据表明基于lncRNA的治疗策略对调节组织血管形成有很大的前景,有望成为CRC未来潜在的治疗靶点。

2.3 侵袭途径肿瘤侵袭是指恶性肿瘤细胞离开原发肿瘤向周围组织进攻,是肿瘤细胞、周围间质相互作用和机体整体调节的结果,其标志是肿瘤细胞突破基底膜。肿瘤侵袭是肿瘤播散的第一步。广义来说,肿瘤细胞侵袭作用也表现为对淋巴管、血管屏障的攻击。

大家熟知的MEG3是编码染色质相关的lncRNA的印迹基因,其在许多原发性肿瘤和癌细胞系中的表达异常并参与肿瘤的发展和转移。MEG3表达与体外侵袭、迁移有关。研究［35］表明在LoVo细胞中过表达MEG3可明显降低细胞中基质金属蛋白酶2和9(matrix metalloproteinase-2/9,MMP-2/MMP-9)的表达,增高基质金属蛋白酶组织抑制物2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2)的表达［39］。 因此,在CRC中过表达 MEG3可能通过影响 TIMP-2、MMP-2及MMP-9的表达来抑制细胞的侵袭、迁移运动能力。Tsang等［40］研究发现在CRC中,H19作为miR-675的前体,与 CRC细胞系和CRC组织中的miR-675表达正相关,因此H19可能作为CRC治疗的潜在目标。已经证实新型lncRNAFer-1样蛋白4(FER1L4)在肿瘤进展中发挥关键的调节作用。在CRC中,FER1L4表达水平与淋巴结转移、血管侵袭和肿瘤浸润深度呈负相关。此外,观察到FER1L4和miR-106a-5p在CRC组织中的表达水平呈显著负相关。FER1L4可能通过抑制miR-106a-5p表达抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭［41］。因此,FER1L4可能在癌症预防和治疗中发挥关键作用。

2.4 Wnt/β-catenin信号途径Wnt信号通路控制胚胎发育过程中运动和增殖等细胞过程,参与维持造血干细胞的潜能和诱导分化。Wnt/β-catenin信号级联反应在CRC发生中起重要作用。它不仅调控EMT,而且调控CRC中的细胞增殖、侵袭和迁移［42］。

研究［43－44］表明,通过 RNA 结合蛋白免疫沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)实验和蛋白免疫印迹(western blot)分析,CASC11和CCAT2分别通过直接靶向hnRNP-K和TCF7L2激活Wnt/β-catenin信号通路途径促进CRC的转移。此外,MALAT1被认为通过激活Wnt/β-catenin信号通路,从而增加β-catenin的核定位来促进CRC细胞发展和转移,同时MALAT1不仅通过PRKA激酶锚蛋白9,而且通过与SFPQ结合并从SFPQ/PTBP2复合物释放致癌基因PTBP2促进CRC细胞增殖、侵袭和迁移［11］。TINCR被证明与体内和体外的CRC增殖和转移相关。潜在的机制是TINCR的缺失增强了EpCAM的水解,随后激活了 Wnt/β-catenin 信号通路［45］。 最近的研究［46－47］证明,DLEU7-AS1 和 TCF7 在 CRC 组织中的表达显著增加,与CRC分期、淋巴结转移、远处转移和不良预后正相关。进一步的western blot分析结果显示,沉默 DLEU7-AS1和 TCF7的表达后 Wnt/βcatenin通路中的关键蛋白(包括β-catenin,c-myc和cyclinD1)的表达降低。因此,DLEU7-AS1和TCF7可能通过调控Wnt/β-catenin通路促进CRC的增殖、侵袭和迁移能力。以上报道的lncRNA通过Wnt信号通路参与CRC的进展和转移,很多未报道的lncRNA尚待研究。

2.5 miRNA相互作用的途径微小RNA(miRNA)可参与CRC的不同转移途径。LncRNA被鉴定为是miRNA的前体,同时也是一种天然竞争的内源性ceRNA。ceRNA是一种全新的调控机制,即不同基因的mRNA可以通过竞争性结合相同的miRNA而相互作用［48］。 研究［49－50］发现 lncRNA 也被证明可以作为天然的分子诱饵起调控作用,或作为“miRNA海绵”来降低miRNA的水平,进而调控CRC增殖、侵袭和迁移。

ZFAS1已被证实在CRC组织和细胞系中高表达,ZFAS1抑制剂可显著抑制CRC细胞在体外和体内的增殖和侵袭,ZFAS1直接与miR-484相互作用。miR-484抑制剂可以逆转ZFAS1敲降对CRC细胞的肿瘤抑制作用［51］。UICLM被证明是CRC肝转移上调转录本之一。体外敲减UICLM的表达抑制CRC细胞增殖、侵袭、EMT和CRC干细胞形成以及体内肿瘤生长和肝转移。进一步研究［52］表明,UICLM作为miR-215的ceRNA调控ZEB2表达。UICLM可能为CRC提供新的预后指标和治疗靶点。HOXA11-AS作为miR-125a-5p的ceRNA,通过将miR-125a-5p导入CRC肝转移瘤来调节PADI2的表达,从而促进CRC中的肝转移［53］。新型 lncRNA UCC通过吸附miR-143促进CRC的进展。生物信息学分析,双荧光素酶报告基因检测和RNA免疫沉淀实验［54］表明,miR-143可以与UCC相互作用,并且 UCC表达与CRC样品中miR-143的表达成反比,并且UCC可能通过作为miR-143的竞争内源性RNA,从而调节该miRNA的靶点。实验结果表明UCC和miR-143有望成为CRC治疗的分子靶标。FBXL19-AS1是转移性CRC中最显著上调的lncRNA。生物信息学分析预测,miR-203可能是FBXL19-AS1的靶点,这通过双荧光素酶报告基因检测证实,揭示了FBXL19-AS1作为分子海绵在负调节 miR-203中的促癌作用［55］。此外,miR-489是一种新型的癌症相关miRNA,在人类癌症中起着抑癌作用。值得注意的是,TWIST1被认为是CRC细胞中miR-489的直接下游靶标［21］。

3 LncRNA有望作为人类癌症的诊断、预后标志物及防治靶点

LncRNA在广泛的癌症中异常表达,它们在促进和维持肿瘤的发生和发展中发挥关键作用,证明了它们有作为生物标志物和治疗靶标的临床潜力［56］。LncRNA作为癌症风险基因:某些单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)与癌症风险有关。癌症全基因组相关研究的大规模数据分析表明大多数SNPs与非编码基因相关。SNPs的存在可能调节相应 ncRNA的表达。事实上,lncRNA的SNPs已被证明与前列腺癌、肺癌、乳腺癌等癌症类型的风险相关［6］。寻找与lncRNA相关的基因组突变表明lncRNA与疾病相关的SNPs可能将lncRNAs定位为癌症风险基因。LncRNA作为诊断标志物:检测人血液、尿液或活组织样品中的lncRNA可能有利于人类癌症的早期诊断和风险检测。例如,HOTAIR在乳腺癌组织和血液中表达上调,并与乳腺癌的不良预后呈正比,可作为乳腺癌诊断和预后的候选标志物。LncRNA作为预后标志物:lncRNA在人类癌症组织中的表达状态可能与癌症分期、转移潜能、靶向治疗的耐药性以及患者预后相关。此外,一些lncRNA靶标的失调与前列腺癌、肺癌和乳腺癌等肿瘤的阶段和预后相关［6］。LncRNA作为治疗靶点:基于反义寡核苷酸的策略正在开发中。LncRNA与肿瘤的抗化疗和靶向治疗相关。例如,HOTAIR的表达激活雌激素受体(estrogen receptor,ER)目标转录程序,并有助于他莫昔芬的耐药性。有研究［56］已证明靶向lncRNA的siRNA可被包封在纳米颗粒材料中,通过静脉注射方式以改善组织分布和药效学。

4 小结与展望

本研究简要介绍了关于lncRNA与CRC转移的相关性研究,总结了参与CRC不同转移途径相关的lncRNA。积累的研究证据［6］表明lncRNA在癌症进展和转移中起关键作用。由于lncRNA生物学研究还处于初期,肿瘤是研究lncRNA表达和功能的最显著的背景。越来越多的lncRNA被发现在肿瘤中差异表达,其中一些被鉴定为是肿瘤发生到转移多步骤过程中的主要调节剂,探索开发基于lncRNA在癌症治疗中的巨大潜力也是大势所趋。然而,目前的研究数据有限,未来应该对CRC不同亚型和大量样本进行微阵列分析才能获得更多更可靠的数据。此外,有研究［12］表明lncRNA可促进许多癌症的血管生成从而促进转移,但lncRNA与CRC血管生成之间关联的研究报道数量有限,未来也将成为研究CRC转移与干预治疗的热点。基于lncRNA的肿瘤诊断仍然存在巨大的挑战,需要更多的努力。随着CRISPR/Cas9技术的最新发展,其可以有效地用于了解人类肿瘤细胞中lncRNA的癌症特异性功能［3］。LncRNA作为细胞内信号传导途径的必要介质,在癌症中的调节作用为控制癌细胞获得其侵袭性和转移性质的新机制和新途径,作为与癌症作斗争的新方法的基础。在很大程度上刺激未来研究工作的新方向和将lncRNAs作为癌症新型预后标志物和治疗靶点的选择。

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