鸭乙型肝炎动物模型在药学领域的应用进展

汪纪楠，施 伟，宋 伟，张亚琦，张寅生，徐宏江

(江苏省抗病毒靶向药物研究重点实验室，正大天晴药业集团股份有限公司研究院，南京 210042)

乙型肝炎病毒(HBV)感染动物模型是抗乙肝药物研发成功的关键因素之一，也是深刻理解乙型肝炎发病机制的重要组成部分，前人在建立乙型肝炎病毒感染动物模型方面做了大量的研究工作[1-5]。鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的基因组、复制方式和发病机制与人乙型肝炎病毒(HHBV)相似，且DHBV的天然宿主容易获得、价格低廉、感染成功率高，因此DHBV感染动物模型是筛选抗HBV药物、研究药理和病理机制的理想模型。本文就近年国内外利用DHBV动物模型在药学领域中的研究应用进行综述，为相关人员提供参考。

1 药物研发领域的应用

DHBV感染动物模型通常利用DHBV阳性鸭血清感染鸭胚或雏鸭，使其肝脏中DHBV DNA持续复制，肝功能出现异常，血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等明显升高。由于鸭病毒复制机制和病理机制非常类似于HBV[2]，因此广泛用于筛选抗乙肝病毒药物、评价药物作用机制以及组合治疗效果[3]。

1.1 体内研究

美国百时美施贵宝(BMS)公司曾经回顾抗乙肝病毒药物恩替卡韦(ETV)的开发历程[4]。ETV于2005年被美国FDA批准上市，此前历经10年研发之路，多种动物模型被用来测试化合物的抗病毒能力。彼时，研究者提出慢性感染土拨鼠乙肝病毒(WHV)的土拨鼠可以作为动物模型来研究抗HBV药物，BMS公司利用此模型进行研究得到了较好的效果[5]。随后研究人员在DHBV感染的北京鸭模型中观察到相似的效果[6]，并在持续DHBV感染鸭模型中评估了ETV联合DNA疫苗的抗病毒功效[7]。通过多年的抗乙肝病毒药物研发工作，该公司研究人员认为创新性动物模型是ETV研发成功的3大关键因素之一。

正大天晴药业集团股份有限公司研究院的科研人员使用DHBV感染的北京鸭研究了自主研发的替诺福韦前药富马酸替诺福韦双特戊酯(BP0018)的体内抗病毒作用[8]，检测了用药前后5和10 d、停药后3 d鸭血清中DHBV DNA的水平，并提取给药10 d后鸭肝脏样本中的总DNA进行分析。结果显示，BP0018能使血清和肝脏中的DHBV DNA显著降低，且停药后无明显反跳现象，表明其可抑制感染雏鸭体内DHBV DNA的复制。研究结果也证实，BP0018对感染鸭无明显不良反应，动物耐受性良好。此外，该课题组还应用此动物模型进行TLR7受体激动剂、恩曲他滨类似物和共价闭环DNA(cccDNA)抑制剂等化合物的体内药效评价(研究结果未发表)，侧面说明此动物模型具有较高的可靠性。

除核苷类似的小分子化合物以外，核酸聚合物也是一大类抗HBV化合物，此类化合物的研究也常用DHBV感染动物模型来进行。法国里昂大学的研究人员在一项临床前研究中评估了核酸聚合物REP 2139-Ca(REP 2139的钙螯合物)与替诺福韦(TDF)和恩替卡韦(ETV)的组合在DHBV动物模型体内的药效[9]，重点关注这种新的药物组合清除肝脏中的病毒表面抗原的能力。利用雏鸭感染DHBV的慢性DHBV携带模型，单用REP 2139-Ca或TDF，REP 2139-Ca+TDF组合以及REP 2139-Ca+TDF+ETV组合，处理28日龄鸭子4周，停药后继续跟踪8周。利用ELISA方法监测血清DHBsAg 和anti-DHBsAg抗体并利用qPCR技术监测血清DHBV DNA、肝脏DHBV DNA和共价闭环DNA(cccDNA)，评估药物组合的抗病毒活性。结果显示，相比于单用TDF组，组合治疗组在停药后2个月内显著减少了大部分鸭子的肝脏中病毒DNA和cccDNA数量，达到了对感染的持续性控制。更重要的是，组合治疗还清除了所有鸭子肝脏中的DHBsAg，显示出功能性控制。研究人员还观察到了REP 2139-Ca与TDF或者TDF+ETV的协同效果。此外，早在2003年该研究组成员就曾利用DHBV慢性感染北京鸭模型研究了阿德福韦(ADV)联合DNA疫苗的抗病毒效果[10]，并于2015年报道了多种核酸聚合物的抗DHBV感染能力[11]，最近又报道了REP 2139单体与TDF和ETV的组合抗DHBV感染的协同效果[12]。

1.2 体外研究

DHBV感染动物模型除了用于进行体内研究以外，还可以进行体外实验大规模筛选化合物。美国德雷克塞尔大学医学院的郭海涛和郭巨涛等通过基于细胞的实验筛选特异性抑制cccDNA形成[13]和抑制HBV核衣壳组装[14]的小分子抑制剂。在前一项研究中，他们采用了创新性的基于细胞的cccDNA实验筛选了包含8.5×104万个类药化合物，得到了两个能够抑制cccDNA产生的双取代磺胺类化合物(DSS)。进一步机制研究中证实DSS化合物既不直接抑制HBV DNA复制也不降低病毒聚合酶活性，而是同时降低cccDNA与其可能的前体“脱蛋白松弛环状DNA(DP-rcDNA)”的水平，其机制可能为妨碍rcDNA转变为cccDNA。此外证明了其中一个化合物能够减少DHBV阳性鸭血清感染的1周龄雏鸭原代肝细胞中cccDNA的生物合成。后一项研究中，他们再次通过基于细胞的筛选实验，筛选了包含26 900个小分子的化合物库，发现一系列氨磺酰苯甲酰胺(SBA)衍生物能够显著减少细胞质中HBV DNA的数量。构效关系(SAR)研究发现了一组双氟取代SBA对人肝癌细胞中的HBV具有亚微摩尔级抗病毒活性。通过机制分析揭示了这些化合物可以剂量依赖性地抑制HBV而非WHV和DHBV的核衣壳蛋白形成。虽然研究工作是在人肝癌细胞中进行的，但是同时评估不同物种的乙肝病毒对将来选择合适的动物模型以研究化合物的体内抗病毒功效具有重要意义。

近日，中国郑州大学的研究人员设计、合成和评估了一系列新的抗HBV核苷衍生物[15]。在细胞模型中5 μmol/L的合成化合物显示出与20 μmol/L的阳性化合物拉米夫定(LAM)相当的活性，在DHBV感染的鸭模型中，化合物1a显著降低了血清和肝脏DHBV DNA(67.4%和53.3%)。模拟的复合体结构显示化合物1a主要通过氢键和范德华力稳定与HBV DNA聚合酶的结合。

综上，DHBV动物模型不论在筛选、评价抗病毒化合物，还是评估组合治疗协同效果方面均具有广泛的应用。此外，DHBV动物模型既可以用于体内研究也可以用于体外筛选。

2 病理机制研究中的应用

DHBV对鸭胚和雏鸭的感染效率高，而对成鸭的感染效率低下，且呈垂直传播，这与HBV的传播基本一致。因此利用DHBV感染动物模型进行机制研究，可以很好地揭示HBV的作用机制。

2.1 感染成功率影响因素研究

分析影响DHBV感染效率的因素可以更好地理解和应用这一模型。澳大利亚悉尼大学的研究人员比较了不同日龄(1日龄和28日龄)鸭感染DHBV的早期阶段的响应情况，以确定感染结果的差异是否与宿主先天免疫响应的差异有关[16]。在成鸭中接种DHBV的早期阶段可以观察到肝细胞中α-干扰素的诱导生成，并且通过招募的效应淋巴细胞得到迅速加强，直接或间接引起感染肝细胞的凋亡和消除。而在1日龄鸭的肝脏中缺乏淋巴细胞浸润，表明1日龄鸭的先天免疫网络缺乏效率。研究结果表明在DHBV感染的早期阶段，缺乏先天免疫而非获得性免疫是雏鸭持续感染DHBV 的重要原因。

中国华中科技大学的研究人员探讨了不同种雏鸭DHBV感染的影响因素[17]。发现不同种鸭的DHBV自然感染率不同，实验用3种鸭的自然感染率在8.75%～17.8%范围内，而不同鸭种对人工感染率的影响不明显。研究人员比较了静脉注射和腹腔注射感染率的差异，发现二者都可以使雏鸭感染DHBV，但静脉注射感染率(80%)高于腹腔注射(65%)。实验中混合喂养中人工感染的雏鸭并不会使未自然感染的雏鸭被感染，提示DHBV传播主要以垂直传播为主，水平传播途径对DHBV的传播影响较小。雏鸭感染后体内高病毒载量可持续20 d以上，不同种鸭感染DHBV后使用抗病毒药物处理的效果一致。

2.2 病毒复制感染机制研究

相比于转基因HBV小鼠模型，DHBV动物模型的优势之一在于可检测到cccDNA，并且其能够自我复制，因此可用于研究病毒的复制感染机制。澳大利亚阿德莱德大学的研究人员利用DHBV感染鸭模型研究了残余DHBV cccDNA的维持是否依赖于正在进行的病毒DNA合成[18]。从急性DHBV感染中恢复的鸭被分为两组，分别使用抗病毒药物ETV或者安慰剂处理，90 d后进行肝组织活检，并未观察到cccDNA的稳定性或者残余cccDNA的水平有显著差异，说明ETV并未使残余DHBV cccDNA的整体水平下降。结果提示残余DHBV cccDNA高度稳定，其维持并不依赖于正在进行的病毒DNA合成。此外，分析表明残余的被感染的细胞以相似的速率转变周围未被感染的肝细胞，或许意味着残余的被感染细胞中的病毒基因表达被高度抑制。整体结果说明慢性HBV感染中，残余DHBV cccDNA稳定，其消除可能依赖于免疫介导的细胞死亡。

法国里昂大学的研究人员在DHBV感染鸭模型中研究了细胞因子(IL-2，IFN-γ)基因与DNA疫苗共递送对DHBV DNA复制的抑制效果，并分析了残存DHBV cccDNA的肝匀浆的感染性[19]。经过连续的DNA疫苗接种联合白细胞介素2(IL-2)和干扰素(IFN)-γ质粒注射，鸭肝脏中仅可检测到痕量cccDNA。然而将这些肝匀浆接种到无DHBV雏鸭体内，则会引起高水平的DHBV感染。结果表明IFN-γ可以增强DNA疫苗的免疫治疗效果，更重要的是肝脏中微量的cccDNA就可以引起非常高滴度的感染，提示需要预防肝脏移植导致的HBV传播。

2.3 治疗策略研究

当前的乙肝治疗策略还无法根除乙肝病毒的cccDNA，因此提出新的治疗策略并应用新的技术手段进行研究相当重要。cccDNA以游离的微小染色体形式存在于被感染肝细胞的细胞核中，充当病毒mRNA合成的转录模板。随着研究的深入，调控染色质的表观遗传学修饰成为一个有潜力的方向[20]。德雷克塞尔大学的郭巨涛等使用DHBV体外细胞模型进行表观遗传调控研究[21]，他们建立了一套实验方法来模拟被病毒感染的肝细胞，在该模型中DHBV的前基因组(pg)RNA转录和DNA复制只依赖于cccDNA。研究结果显示cccDNA转录需要组蛋白去乙酰化酶活性，而干扰素(IFN)-α对cccDNA转录的持久抑制与其减少cccDNA微小染色体中的组蛋白H3K9和H3K27的甲基化有关。此外还观察到一些组蛋白去乙酰化酶的抑制剂可以抑制cccDNA转录并以剂量依赖方式减少HBV复制。

最近，规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统被当作强大有效的工具用于病毒基因组编辑。首都医科大学和郑州大学的研究者[22]从DHBV感染雏鸭的肝脏中提取原代肝细胞，研究了CRISPR/Cas9系统靶向抑制DHBV DNA尤其是cccDNA的效果，并且评估了CRISPR/Cas9系统和ETV的组合效果。研究发现了两个靶向DHBV基因组的单一导向RNA(sgRNAs)可以成功抑制DHBV总DNA和cccDNA，且ETV可以增强CRISPR/Cas9系统对DHBV总DNA的抑制效果。这一发现表明靶向DHBV基因组特定位点的CRISPR/Cas9系统可能成为一种有效技术用于抑制原代鸭肝细胞的DHBV感染。此研究还有待于进一步的体内验证。

中国四川农业大学的研究者设计了表达包膜和衣壳融合蛋白的DHBV DNA疫苗来增强鸭子的免疫响应广度[23]。用减毒鼠伤寒沙门菌作为载体和佐剂来提高免疫响应的强度。基于这种策略，产生了新的DNA疫苗(SL7207-pVAX1-LC和SL7207-pVAX1-SC)。接种这种疫苗的鸭体内的CD4和CD8 T基因的转录水平和抗体(IgY)水平均高于单基因递送组。此外，DHBV感染后的肝脏中cccDNA拷贝数也证明了融合疫苗可以增强抗DHBV感染的效果。该研究丰富了科研人员对DHBV的包膜和衣壳融合蛋白抗原性的理解，并展示了鼠伤寒沙门氏菌在递送DHBV疫苗方面的价值。

综上，DHBV感染动物模型在机制研究方面也具有明显的优势，为开发新靶点、新机制的抗HBV药物、疫苗和治疗策略提供了强有力的支持作用。

3 总结和展望

DHBV感染动物模型在药物研发领域和疾病机制研究领域具有相当广泛的应用，为广大科研工作者提供了一种方便、经济、高效的研究工具。分析其原因主要有以下几个方面:(1)模型获取容易：相比于哺乳动物，鸭的来源更广泛，饲养条件更简单，繁殖周期更短，且DHBV不会感染人，具有更安全的特点；(2)感染成功率高：不同种属鸭子的自然感染率虽然存在差异，但是不同鸭种对人工感染率的影响不明显，静脉注射比腹腔注射具有更高的感染率；(3)病毒复制机制相似：DHBV的复制机制与HBV高度一致，不同于转基因动物模型，DHBV感染鸭体内的病毒可自我复制且可以垂直传播，此外，由于模型动物的血液中存在完整的病毒颗粒且肝脏中存在cccDNA，用鸭血清或肝匀浆接种原代培养的肝细胞后可以感染细胞，因此可以用于大规模体外实验；(4)可出现肝脏病理损伤：DHBV动物模型在一定时间以内能够持续高表达DHBV DNA，而且会引起肝脏的病理性损伤，这也是和HBV全基因组转基因小鼠最主要的区别。

综上所述，DHBV动物模型不但可以用于评价抗病毒药物，也能用于研究肝炎、肝癌病理机制，是目前为止该领域内最方便可靠的动物模型。虽然DHBV动物模型具有诸多优势，但是不可否认目前尚无任何单一模型可以准确反映出HBV感染的所有特征，今后的研究中仍需结合多种模型进行综合评价。