肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测在涂阴肺结核早期诊断中的应用价值

钟剑峰 童涌 童照威 宋群 王伟洪

近年来随着社会老龄化以及免疫抑制剂的过度使用，结核病发病有增多趋势[1]。根据2015年中国传染病网络直报系统，报告肺结核患者86.4万例；其中痰涂片阴性（涂阴）患者62万例，占总发病数的71.8%[2]。近年来，随着结核杆菌利福平耐药基因（Xpert MTB/RIF）检测技术的应用，痰涂片阳性（涂阳）及利福平耐药肺结核的早期诊断与治疗水平有了很大的提高，但多数涂阴肺结核患者仍不能得到及时的诊断与治疗[3-4]。因此，提高及时诊断与治疗涂阴肺结核患者的水平，对有效控制结核病有着举足轻重的作用。大部分涂阴肺结核患者的临床症状不明显，痰量少，所以无法获得合格的痰标本，而通过支气管镜留取肺泡灌洗液进行检测是一个很好的方法。本文通过对涂阴肺结核患者进行气管镜检查，留取肺泡灌洗液进行抗酸染色涂片、分枝杆菌液体培养及药敏试验、Xpert MTB/RIF检测，以探讨肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测在涂阴肺结核早期诊断中的应用价值。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2014年7月至2016年6月本院收住的213例患者为研究对象，所有患者3次痰找抗酸杆菌（即时痰、夜间痰、晨痰）均为阴性。均行支气管镜检查，最终诊断为涂阴肺结核［参照《中国结核病防治规划实施工作指南（2008版）》涂阴肺结核的诊断标准］157例为观察组；经进一步气管镜、肺穿刺活检及诊断性抗炎治疗等随访观察排除结核病的56例患者为对照组。观察组中男 97 例，女 60 例；年龄 17～80（51.7±4.6）岁。对照组中男 37 例，女 19 例；年龄 28～82（49.3±3.7）岁。两组患者性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。所有患者签署支气管镜检查知情同意书，行支气管镜采集标本前均未予抗结核治疗。

1.2 仪器和试剂 抗酸杆菌涂片染色液（4×250ml，批号：YZB/粤珠0063-2013）购自珠海贝索生物技术有限公司；全自动分枝杆菌培养鉴定药敏系统（型号：BACTEC MGIT 960）及其配套试剂（批号：YZB/USA 0069-2015）均购自美国BD公司；Xpert MTB/RIF检测设备（型号：GeneXpert MTB/RIF）及其试剂盒（批号：YZB/SWE 0773-2014）购自美国Cepheid公司。

1.3 检查方法 所有患者行支气管镜检查后收集肺泡灌洗液3份（5ml/份），分别行抗酸染色涂片、分枝杆菌液体培养与Xpert MTB/RIF检测，若液体培养阳性则进一步行药敏试验。（1）抗酸染色涂片法：肺泡灌洗液标本离心浓缩，参照《结核病实验室标准化操作与网络建设》进行操作[5]。（2）分枝杆菌液体培养法：应用BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌培养鉴定药敏系统进行分枝杆菌的快速培养与药敏鉴定。（3）Xpert MTB/RIF检测法：按照Xpert MTB/RIF设备说明书进行操作，将采集到的肺泡灌洗液标本抽取1ml与含有氢氧化钠及异丙醇的处理液2ml混合，震荡30s，室温静置15min，使生物危险度下降；再吸取2ml处理后的标本移至一次性多室反应盒中，将反应盒置入检测模块，约2h读取结果。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者Xpert MTB/RIF检测结果比较 观察组肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测阳性率为73.9%（116/157），明显高于对照组的1.8%（1/56），两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 观察组抗酸染色涂片、分枝杆菌液体培养及Xpert MTB/RIF检测阳性率比较 观察组中，肺泡灌洗液抗酸染色涂片、分枝杆菌液体培养及Xpert MTB/RIF检测阳性率分别为 20.4%（32/157）、38.9%（61/157）和 73.9%（116/157），其中抗酸染色涂片阳性的32例患者分枝杆菌液体培养均为阳性，分枝杆菌液体培养阳性的61例患者Xpert MTB/RIF检测均为阳性。以上3种方法阳性率经两两比较，XpertMTB/RIF检测法＞分枝杆菌液体培养法＞抗酸染色涂片法，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。Xpert MTB/RIF检测阳性而分枝杆菌液体培养阴性的55例患者中，Xpert MTB/RIF检测结果均为低含量或极低含量。

2.3 Xpert MTB/RIF检测诊断利福平耐药的效能 观察组中分枝杆菌液体培养阳性的61例患者经Xpert MTB/RIF检测均为阳性，对这61例患者进行药敏试验，鉴定对利福平的耐药性。以分枝杆菌液体培养药敏试验结果为金标准，液体培养药敏鉴定利福平耐药10例；而Xpert MTB/RIF检测利福平耐药11例，其中液体培养耐药的10例患者均被检出。Xpert MTB/RIF检测诊断利福平耐药的灵敏度为100.0%（10/10），特异度为98.0%（50/51），与分枝杆菌液体培养的一致性较好。

3 讨论

目前确诊结核病的方法主要为抗酸染色涂片和分枝杆菌液体培养。抗酸染色涂片法具有快速、简单的特点，但无法区分非结核分枝杆菌，同时对标本的菌量要求高，一般标本中结核菌数量≥10 000个/ml可检出阳性；分枝杆菌液体培养法能提高一定的阳性率，同时也可区分非结核分枝杆菌以及检测结核菌的耐药性，但是所需时间较长，可能延误疾病的诊治，增加疾病传播的风险[6]。Xpert MTB/RIF检测技术是由美国Cepheid公司开发的一个结核菌检测平台，它是一种半巢式的荧光定量PCR体外诊断技术，能自动提取rpoB基因进行扩增，再用分子探针覆盖81bp核心区，确定对利福平的耐药性，该设备将样品制备和定量PCR整合在一个封闭试剂盒中自动完成，2h内能从患者标本中检测是否含有结核杆菌以及对利福平的耐药性[7]。多项研究表明，该技术对涂阳标本的灵敏度达98%～100%[8-9]。目前，该技术在结核病防治中应用已被WHO许可。

现阶段我国涂阴肺结核约占所有肺结核的70%，这些患者咳嗽、咳痰多不明显，很难留取合格的痰标本，目前尚缺乏有效的检测手段。支气管镜检查能直接观察气管、支气管及更远端，可以进行支气管黏膜活检；同时可对病灶所在的肺叶、肺段进行肺泡灌洗，留取灌洗液进行检测，从而增加阳性率。本研究两组患者均进行支气管镜检查，留取肺泡灌洗液进行检测。观察组肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测阳性率（73.9%）明显高于对照组（1.8%），提示Xpert MTB/RIF检测在涂阴肺结核患者肺泡灌洗液中有较高的特异度，与牛波等[10]报道结果一致。观察组157例患者肺泡灌洗液抗酸染色涂片、分枝杆菌液体及Xpert MTB/RIF检测阳性率比较结果：Xpert MTB/RIF检测法＞分枝杆菌液体培养法＞抗酸染色涂片法，提示肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测对涂阴肺结核患者的诊断意义优于分枝杆菌液体培养法、抗酸染色涂片法，与李妍等[11]研究结果一致。Xpert MTB/RIF检测阳性而分枝杆菌液体培养阴性的55例患者中，Xpert MTB/RIF检测结果均为低含量或极低含量，与Rachow等[12]研究结果一致，提示在含菌量低的标本中，Xpert MTB/RIF检测灵敏度优于分枝杆菌液体培养法，更适用于临床上涂阴肺结核的诊断。有研究表明，Xpert MTB/RIF检测对结核杆菌有特异性，与非结核分枝杆菌无交叉反应[13]，提示临床上遇到涂片阳性但Xpert MTB/RIF检测阴性者，需考虑非结核分枝杆菌的可能。

以分枝杆菌液体培养药敏试验结果为金标准，Xpert MTB/RIF检测诊断利福平耐药的灵敏度为100.0%，特异度为98.0%，两者一致性良好，与国外报道一致[14-15]。其中有1例患者Xpert MTB/RIF检测出利福平耐药，而药敏试验提示敏感，因条件限制，未进行rpoB基因测序，故最终未明确其耐药性；后经常规一线标准化方案治疗及跟踪随访，患者病灶吸收，病情好转，故考虑为Xpert MTB/RIF检测假阳性。结合相关文献，Xpert MTB/RIF检测假阳性的原因可能有以下3个方面：（1）仪器设备中B探针循环阈值延迟，导致出现假阳性结果[16]；（2）沉默子的突变导致核苷酸位点的改变，但是不改变所编码的蛋白质性质[17]；（3）标本中结核分枝杆菌数量少所致[18]。由于Xpert MTB/RIF检测存在假阳性的可能，当临床上发现Xpert MTB/RIF检测耐药时，WHO推荐在进行常规药物治疗的同时对Xpert MTB/RIF检测结果进行验证，包括常规药敏试验或rpoB基因测序等[19]。

综上所述，Xpert MTB/RIF检测是一种新的结核病基因诊断技术，具有快速高效、操作简单、安全性高、能同时检测利福平耐药性等特点，肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测诊断涂阴肺结核的灵敏度和特异度均较高，建议在涂阴肺结核患者中开展肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF检测。

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