唾液糖蛋白糖链和肿瘤

(西北大学生命科学学院功能糖组学实验室,西安 710069)

糖类物质不仅同核酸一样是重要的生物信息分子，同时也是基因信息的延续。随着分子生物学及细胞生物学的发展，糖类物质及其衍生物与复合物的其它诸多生物功能不断被认识，糖类物质不仅可以以多糖或游离寡糖的形式直接参与生命过程，而且可以以糖复合物，如糖蛋白、蛋白多糖及糖脂等形式参与许多重要的生命活动。此外，糖复合物还与许多疾病，如癌症、细菌和病毒感染而导致的疾病发生与发展有着密切的关系[1-2]。

近些年来，唾液作为重要的临床诊断样本已被广泛应用于多种疾病诸如艾滋病、自身免疫性疾病、酒精性肝硬变、囊性纤维病、糖尿病、心血管病、龋病和癌症等疾病的药物水平监测、诊断、病情监控和疗效评价当中[3-7]。我们以往的研究工作表明唾液蛋白质糖基化的改变与肝癌、胃癌和乳腺癌等疾病的发生发展具有较高的关联性。而从变化的唾液糖蛋白糖链中找到的与疾病相关的生物标志物，也预示着基于唾液检测的新技术和新方法会逐渐成为今后非侵袭性临床诊断发展的一个方向[8-11]。

1 唾液作为诊断介质的优势和可行性

人体唾液由腮腺、下颌下腺、舌下腺和其他一些小腺体分泌，正常人分泌唾液中水分占九成以上，此外还包含黏多糖、脂类、矿物质和其他小分子物质与黏蛋白、球蛋白、抑制和消灭细菌和病毒的免疫球蛋白等蛋白质。唾液能起到维持口腔内环境稳定、润滑口腔壁、方便咀嚼、发声和吞咽的作用。唾液总量和组成上的变化，不管是由口腔局部病变还是机体整体异常状况引起，都可能会造成唾液功能的缺陷。研究发现，唾液中除了含有一些本底表达的蛋白质(在不同性别和不同年龄段都几乎无差别表达的蛋白质)外，还含有一些可以反应人体身体健康和生理状况的蛋白质，这些蛋白质往往在不同年龄、性别、病理和生理状况的人群中出现差异性表达。分析与研究唾液中这些差异表达的蛋白质是进行人体健康状况评估和疾病相关生物标记物研究的基础[12]。

肿瘤组织和内分泌器官一样，可以分泌激素、淋巴因子和细胞因子，通过血液运输到达远端器官，对全身产生影响。一旦这些因子到达唾液腺，或随唾液分泌进入口腔或导致唾液中的基因转录谱发生改变，将会引起某些蛋白质的丰度或种类改变，从而成为唾液中的肿瘤生物标志物。血液中的部分蛋白质成分同样存在于唾液中，所以唾液能作为一种非侵入性的诊断代替物代替血液反映出血液中部分蛋白质水平的变化，从而可通过唾液的检测来进行疾病的诊断[13-15]。目前研究发现，人唾液中有1939种蛋白质，人血浆中有3020种蛋白质，27%的唾液蛋白质组与血浆蛋白质组重合[16]。这表明许多血液循环中的生物标志物可能在唾液中得到鉴定，也进一步说明唾液可被用于诊断疾病。此外血浆蛋白质组学发现的177个与心血管疾病相关的潜在生物标志物的蛋白质中，40%的蛋白质同样出现在唾液蛋白质组中；在已列出的1058个血浆蛋白质组潜在癌症相关生物标志物的蛋白质中，34%的蛋白质同样出现在唾液蛋白质组中。但两者并不是简单的包含关系，唾液和血浆的蛋白质组比较结果显示，有些蛋白质只在唾液蛋白质组中出现，而没有出现在血浆蛋白质组中，表明两者并不能够等同。与此同时，通过对唾液、血浆和人类全蛋白质组的GO(gene ontology)注释比较，发现唾液和血浆蛋白质组中细胞外基质组分较多，而细胞内液组分较少，提示唾液和血浆蛋白质组都具有分泌蛋白质组的特征；在生物学过程和分子功能方面的分析结果提示，唾液蛋白质组和血浆蛋白质组具有相似性。因此，从唾液中筛选肿瘤标志物具有科学性和可行性，并具有非损伤性检测的优势[15-16]。虽然口腔中存在着人体中最多样的微生物群落，但最近的研究表明，其存在并不会对唾液蛋白质的定量研究造成干扰[17]。

2 糖组学研究中糖链分析的策略

糖组学(glycomics)是近年来发展起来的生命科学前沿领域之一，是从分析和破解一个生物或一个细胞全部糖类所含信息的角度入手，研究糖类的分子结构、表达调控、功能多样性、以及糖类与疾病之间关系的科学[1,18]。糖蛋白及糖链结构的鉴定多采用质谱技术、毛细管电泳技术、气相色谱技术及凝集素芯片技术[9,18-19]。在唾液中寻找年龄和性别相关的标志性糖蛋白也成为一个新的研究热点。如免疫球蛋白A，糖蛋白340和粘蛋白5B等在唾液中的丰度随着年龄的增加而增加，而粘蛋白7的丰度却随着年龄的增加而减少。其中粘蛋白5B上的糖链谱随着血型的不同而有所不同[20-22]。唾液作为人体抵御呼吸道病毒感染的第一道天然屏障，其中的糖蛋白还发挥着重要的作用。如唾液中α-2巨球蛋白，粘蛋白5B和唾液糖蛋白340等通过其上Siaα-2,3或α-2,6连接的糖链结合甲型流感病毒血凝素来中和并抑制流感病毒的感染[23]。健康老年人唾液可以提供更多的糖蛋白唾液酸α2-3/6糖链结构与流感病毒血凝素结合，因而具有更强抵抗流感病毒的能力[9]。慢性病(如糖尿病和肝病)患者唾液中糖蛋白唾液酸α2-3糖链结构的丰度比同性别同年龄段健康人唾液中的显著降低，表明这些患者易感染禽流感病毒，由此证明通过唾液检测筛查流感病毒易感人群具有可行性[10]。

3 唾液糖蛋白糖链的应用

3.1健康人唾液糖蛋白糖链攻克癌症在近代医学史上一直是一个棘手的难题，近年来对于癌症的研究，大多从细胞周期的失序与核酸的异常表达着手来研究癌细胞的扩增、分化与迁移等问题，传统和常规的研究方法在对于肿瘤的研究中越来越接近一个瓶颈。而一些新的方法如糖组学等研究方法从另一个层面对攻克癌症这一顽疾提供了新的思路。作为对后续应用糖组学技术研究癌症患者唾液的对照，对健康人群的研究也是必不可少的。

利用高覆盖率凝集素芯片对健康志愿者(Healthy volunteers,HV)的唾液糖蛋白糖链谱做了比较研究，发现有七种凝集素显示明显的年龄差异，识别Siaα2-3Galβ1-4Glc (NAc)的MAL-Ⅱ，识别Siaα2-6Gal /GalNAc的SNA，识别高甘露糖和Manα1-6Man的NPA，以及识别a Gal和T抗原的PTL-Ⅱ四种凝集素在老年人唾液样本中归一化后荧光强度(Normalized fluorescent intensities,NFIs)显著增加，而识别Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc和Fucα1-3(Galβ1 -4)GlcNAc的LTL在老年人和女性成年人中的NFIs都显著增加。相反地，识别多价唾液酸和(GlcNAc)n的WGA在老年人中NFIs显著降低，识别β-Gal，Galβ-1,4GlcNAc和Galβ1-3GlcNAc的RCA120在成年人和老年人中NFIs都显著降低。有七种凝集素显示明显的性别差异，识别GalNAcα/β1-3/6Gal的WFA，识别(GlcNAc)n的LEL和STL，以及识别高甘露糖和Manα1-3Man的GNA对应NFIs在三个年龄组中都是女性高于男性。相反地，识别Fucα-1,6GlcNAc的PSA和识别T抗原的PNA对应NFIs在儿童组和成年人组中男性高于女性，而识别高甘露糖和Manα1-6Man的NPA对应NFIs在成年人组和老年人组男性高于女性。凝集素印迹结果中，LTL与老年人和女性成年人唾液样本结合的信号强度显著高于与其它样本结合的强度。MAL-Ⅱ和NPA与老年人唾液样本结合的信号强度都显著高于与其它样本结合的强度。然而，RCA120与成年人和老年人唾液样本结合的信号强度要显著低于与儿童唾液结合的强度。另外，WFA和GNA与女性唾液样本结合的信号强度显著高于与男性唾液结合的强度，而NPA与男性唾液样本结合的信号强度要显著高于女性唾液结合的强度。这些结果与凝集素芯片的结果一致[9]。

3.2肝癌发生过程中患者唾液糖蛋白糖链我国90%以上的肝癌为肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)，75%～80%的HCC发病与肝脏慢性病毒性感染有关，世界范围内80%～90%的HCC患者伴随有肝纤维化[24-25]。目前研究表明：在肝病的炎症、纤维化、癌变的过程中均有糖蛋白糖链结构和功能的改变，糖链因其结构复杂、功能多样包含了巨大的信息量，一旦在翻译后的修饰过程中发生糖链修饰紊乱，就会产生严重的后果。如在病理状态下，由于糖代谢酶类活力的改变或缺陷，可使糖蛋白上的糖链数量和结构产生异常，导致细胞功能失常，甚至出现恶性发展[26-27]。

通过综合比较凝集素芯片、唾液芯片的结果，筛选出了14种凝集素，它们能够区分HV、乙肝(HBV-induced chronic hepatitis,HB)、乙肝后肝硬化(HBV-induced cirrhosis,HC)和HCC患者之间不同的唾液糖蛋白糖链结构。例如识别Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc 与Fucα1-3(Galβ1-4)GlcNAc的LTL的NFIs在所有慢性肝病患者中相较于HV均显著上调，但是HCC 患者中相较于HC患者上调；识别Galβ-1,4GlcNAc 的RCA120及识别β-D-GlcNAc的DSA在HB患者的 NFIs同HV相比显著升高，在HC与HCC中同HB患者相比显著下调；识别高甘露糖型和 Manα1-3Man 的GNA在所有肝病患者中的NFIs同HV组相比均显著上调，HC与HCC患者中与HB患者相比均显著下调；识别平分型 GlcNAc,双天线,三天线 及四天线型的复杂N-糖的PHA-E+L在所有肝病患者中的NFIs同HV相比均显著上调，在HC同HB及HCC患者相比均显著下调；识别(GlcNAc)n的STL与WGA在肝病患者中的NFIs较HV均显著下调；识别岩藻糖基化的AAL仅在HCC患者中显示下调；识别Galα1-3(Fucα1-2)Gal的EEL的NFIs在所有肝病患者中同HV相比均下调，在HCC中同HB与HC患者相比均显著上调；识别T抗原的ACA的NFIs在HB与HCC患者中较HV下调，在HC中同HB与HCC患者相比显著上调。

为了评估上述糖型作为潜在分子标志物诊断HB、 HC及HCC的可靠性以及构建诊断模型，由凝集素芯片、唾液芯片筛选出的14种凝集素制成的小芯片用于检测训练集样本(HV：55例，HB：49例，HC：65例，以及HCC：63例)。结果显示有5种凝集素(MAL-Ⅱ,UEA-I,PTL-I,GNA 及 MAL-I)识别的唾液糖链结构的表达在肝病发展过程中同HV相比均发生了显著变化；5种凝集素(RCA120,DSA,PHA-E+L,AAL及 ACA)识别的唾液糖链结构的表达在HC及HCC患者中同HB组相比均发生显著改变；7种凝集素(PTL-I,LTL,RCA120,DSA,STL,ACA 及MAL-I)识别的唾液糖链结构在HC及HCC患者中发生显著变化。

使用MALDI-TOF/TOF-MS对HV、HB、HC和HCC患者唾液中的N-链糖进行了分析，发现他们分别有40、47、29和33个N-糖链峰。有15 个N-糖链峰(例如，m/z 1647.587、1688.613和2101.755)在所有人群中都有；3个N-糖链峰(m/z 2596.925、 2756.962和2921.031)在HV中是独有的；2个N-糖链峰(m/z 1898.676和1971.692) 在HB患者中是独特的；5个N-糖链峰(m /z 1954.677、2507.914、2580.930、2637.952和3092.120)在HC中是独有的；3个N-糖链峰(m/z 2240.830、2507.914和3931.338)在HCC中是独有的。在HCC中，岩藻糖化的N-糖链的比例最高(84.8%)，而其中的唾液酸化的N-糖链的比例最低(12.1%)。这些数据提供区分HB、HC和HCC的重要信息，并能促进唾液糖链肝癌生物标志物的发现[11]。

3.3胃癌发生过程中患者唾液糖蛋白糖链国际癌症研究机构的最新资料表明，胃癌是全球最常见的五种恶性肿瘤之一，据《Cancer Statistics in China,2015》统计结果显示，胃癌发病率和死亡率在恶性肿瘤中位列第二。在我国，2015年新增胃癌病例67.9万人，因胃癌死亡人数为49.8万人，胃癌的患病率和死亡率均是世界平均水平的两倍多。目前胃癌的诊断还缺乏特异性标志物，而应用糖组学技术研究胃癌患者唾液，则有可能提供有价值的潜在诊断标志物。

凝集素芯片结果显示有15种凝集素识别的糖链结构在HV、萎缩性胃炎(Atrophic gastritis patients,AG)和胃癌患者(Gastric cancer patients,GC)患者之间存在显著差异。相较于HV，识别α-D-Man和Fucα-1,6GlcNAc糖链结构的PSA以及识别Bisecting GlcNAc和Complex-type N-glycan with outer Gal糖链结构的PHA-E这两种凝集素的NFIs在AG和GC患者中低表达；而识别Galβ-1,4GlcNAc(type Ⅱ)和Galβ1-3GlcNAc (type I) 糖链结构的ECA、识别High-Mannose,Manα1-3Man和Manα1- 6Man糖链结构的HHL、识别Galβ1-3 GalNAcα-Ser/Thr(T) 糖链结构的PNA、识别Galα1-3(Fucα1-2)Gal (blood group B antigen) 糖链结构的EEL、识别Galβ1-3GalNAc和GalNAc糖链结构的MPL以及识别αGalNAc和αGal糖链结构的GSL-I这六种凝集素的NFIs在AG和GC患者中高表达；识别β-D-GlcNA,(GlcNAcβ1-4)n和Galβ1-4GlcNAc糖链结构的DSA、识别(GlcNAc)n和High Mannose-type N-glycan糖链结构的LEL两种凝集素的NFIs在AG中显著上调；识别Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc 和 Fucα1-3(Galβ1-4) GlcNAc糖链结构的LTL的NFIs在AG患者中显著下调；识别terminal GalNAc,GalNAcα-Ser/Thr(Tn)和GalNAcα1-3Gal糖链结构的VVA，识别α-Gal,α-GalNAc,Galα-1,3Gal以及与Galα-1,6Glc糖链结构的BS-I，识别α-or β-linked terminal GalNAc,(GalNAc)n和 GalNAcα1-3Gal糖链结构的三种凝集素SBA在GC患者中显著上调； 识别Fucα1-6GlcNAc (core fucose) 和Fucα1-3 (Galβ1-4)GlcNAc糖链结构的AAL在GC患者中显著下调。

利用唾液芯片以及凝集素印迹技术验证凝集素芯片结果，唾液芯片与凝集素印迹实验结果均与凝集素芯片的结果一致。从整体糖链水平着手，聚类分析以及主成分分析共同显示了唾液糖蛋白糖型能够用于区分HV、AG和GC患者。GC诊断模型在验证组中达到的较好的诊断效果(AUC：0.89，敏感度：0.96，特异性：0.80)，能够成功区分出23例GC患者中的22例，24例AG中的19例，30例健康志愿者中的24例；AG诊断模型同样获得了较好的诊断效果(AUC：0.83，敏感度：0.92，特异性：0.72)，能够成功区分出24例AG患者中的22例，23例GC患者中的13例，30例HV中的25例[8]。

此外，利用MALDI-TOF/TOF-MS鉴定了凝集素AAL分离的糖蛋白上糖链的完整结构，结果显示了AAL分离的糖蛋白的岩藻糖基化糖链类型在HV、AG和GC患者中存在显著的差异，岩藻糖基化O-糖链种类的数量在GC的发展过程中呈现出减少的趋势。值的关注的是，m/z 1776.629 是HV和AG患者质谱图中最高丰度的糖链峰(岩藻糖基化)，在GC患者中则成为一个低丰度的糖链峰。而GC患者中2个最高丰度的糖链峰(m/z 1730.636和1752.610)指示为同一种糖链(二者离子不同，分别为 [M+H]+和[M+Na]+)，在HV和AG患者中则是中等丰度的糖链峰。由此可见，唾液糖蛋白糖链具有成为胃癌诊断标志物的潜能。

3.4乳腺癌发生过程中患者唾液糖蛋白糖链乳腺癌是全世界范围内女性发病率最高的一类恶性肿瘤。大量研究表明：伴随肿瘤的发生与发展，患者肿瘤组织及体液中蛋白质糖基化水平常发生异常改变。目前，尚无理想的体外分子标志物可用于乳腺癌的早期诊断，但糖组学技术的应用有可能打破这一局面。

凝集素芯片技术也用于了对健康女性志愿者(healthy volunteers，HV)、良性乳腺肿瘤/囊肿患者(benign breast diseases patients，BB)、Ⅰ期乳腺癌患者(patients with breast cancer in I stage，BC-Ⅰ)以及Ⅱ期乳腺癌患者(patients with breast cancer in Ⅱ stage，BC-Ⅱ)唾液中的蛋白质糖链结构的分析。混合唾液样本凝集素芯片结果表明，11种凝集素的NFIs在HV、BB、BC-Ⅰ以及BC-Ⅱ混合样本中具有显著差异：其中5种凝集素(DBA、PNA、PHA-E+L、UEA-I和PWM)特异性识别的αGalNAc、GalNAcα1-3(Fucα1-2)Gal、Galβ1-3GalNAcα、平分型GlcNAc、多天线型N-聚糖、Fucα1-2Galβ1-4Glc(NAc)以及分支(LacNAc)n糖链在至少一种乳腺疾病患者唾液中较HV表达水平发生改变。另外6种凝集素(MAL-I、ECA、NPA、BPL、PTL-Ⅱ和BS-I)特异性识别的Galβ1-4/3GlcNAc、High-Man、Manα1-6Man、Galβ1-3GalNAcα- Ser/Thr以及Galα1-3/6Gal/Glc糖链结构表达水平在BB、BC-Ⅰ或BC-Ⅱ混合唾液样本中具有显著性差异。随后利用4种凝集素(PHA-E+L、NPA、MAL-I以及BS-I)进行凝集素印迹实验，证明了混合唾液样本芯片结果的准确性。

经过训练集个例唾液凝集芯片进一步筛选，11种凝集素中的8种凝集素(PNA、PHA-E+L、UEA-I、PWM、MAL-I、NPA、BS-I和PTL-II)以及PHA-E作为候选凝集素进行ROC曲线分析。结果发现仅有PHA-E+L和PWM具有较高的鉴别诊断能力(ROC曲线线下面积(AUC)>0.70)，表明单一凝集素无法应用于BB、BC-Ⅰ 和BC-Ⅱ样本的鉴别。因此基于9种候选凝集素，通过Logistic回归构建4个诊断模型：Model BD、Model BB、Model BC-Ⅰ及Model BC-Ⅱ用于鉴别不同乳腺疾病患者。经验证集个例样本验证，Model BD获得了较好的诊断效果(AUC：0.902、灵敏度：0.823、特异性：0.839)，能够准确鉴别出96例乳腺疾病患者中的79例，31例HV中的26例；Model BB(AUC：0.796、灵敏度：0.727、特异性：0.767)可准确鉴别出30例BB中的23例，66例乳腺癌患者中的48例；此外，Model BC-Ⅰ(AUC：0.781、灵敏度：0.700、特异性：0.864)可准确鉴别出30例BC-Ⅰ组中的21例，其余两个患病组66例样本中的57例；而Model BC-Ⅱ(AUC：0.759、灵敏度：0.861、特异性：0.550)可准确鉴别出36例BC-Ⅱ组中的31例，其余两个患者组60例样本中的33例。验证集中诊断模型的ROC-AUC值均高于0.75，仍能具有较高的鉴别诊断能力，表明乳腺癌患者唾液中蛋白质的异常糖链结构有望成为潜在的体外检测标志物，用于乳腺癌患者的早期筛查。

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