Twist基因与食管癌关系的研究进展

赵荣荣，龚太乾

Twist 是位于常染色体上的编码碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)的转录因子，最初很多研究表明，Twist主要在果蝇的胚胎发育中起着关键调控作用，尤其在中胚层的形成和分化中起着重要作用[1]。而近年来越来越多的研究发现，Twist作为一种癌基因，与上皮-间质转变(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及恶性肿瘤的生长、侵袭、转移和细胞凋亡关系密切[2-5]。鉴于Twist在EMT及肿瘤的发生、侵袭、转移和预后中都发挥着很重要的作用，Twist有望作为恶性肿瘤重要的诊断标志物和潜在的药物治疗靶点，并且还可作为预测患者预后的新指标。

虽然目前关于Twist与肿瘤的关系研究较多，但还未见文献就Twist与食管癌的关系进行总结。作者就Twist与食管癌的发生发展的研究现状作一综述。

1 Twist简介

Twist是位于常染色体上的基本的bHLH家族的转录因子，在胚胎发育中起重要作用[1]。在人类中Twist包含有2种，即Twist1和Twist2，它们编码的蛋白都有相同的bHLH结构域，Twist1又常被称为Twist[6]。Twist能够识别短的DNA保守序列CANNTG，即E-box结构域。Twist在不同的种属之间序列高度保守,在小鼠和人类的氨基酸序列具有96%的同源性，而其DNA结合区域更是具有100%的序列保守，它们都能结合一种E-box的DNA序列[7]。E-box存在于许多基因中，在不同类型的器官发育中，Twist通过转录因子调控方式抑制或活化下游基因，从而对器官的发育产生重要的调控作用。

人类的Twist基因位于7p21.2，包含2个外显子和1个内含子。第一个外显子包含1个ATG区域随后是1个编码202个氨基酸的开放阅读框。开放阅读框后是1个含有45 bp的不翻译的外显子区域，1个536 bp的内含子区及另一个不翻译的外显子区(65位和415位有2个潜在的聚腺苷酸位点)[7]。人类Twist的分子量大约为21 kDa，等电点为9.6。这个蛋白在临近N端的区域包含着更有极性的氨基酸区域，而在C端即bHLH区域则没有极性，所以Twist的N端比C端更有极性。人类Twist蛋白与鼠的Twist有着96%的同源序列。而果蝇有490个氨基酸序列的Twist，比人类、鼠、爪蟾的氨基酸序列都大。

2 Twist与EMT

EMT指上皮细胞失去了分化的特性，包括细胞与细胞之间的连接及上皮细胞的极性，而具有了间质细胞的特性，比如浸润、游走和侵袭的能力。它是胚胎发育的一个基本过程，使得在特殊部位产生的上皮细胞从上皮组织中分离出来并迁移到其他位置，是正常发育、伤口愈合及恶性上皮肿瘤发生的基础。E钙黏蛋白(E-cadherin)的减少或丢失是EMT最重要的标志性变化。

Twist是一种bHLH转录因子，它已经被鉴定通过调控E-cadherin的表达在EMT诱导的转移中起重要的作用。Gao等[8]研究了食管鳞癌中Twist的表达与食管癌EMT之间的相关性，并探索了Twist表达和肿瘤渗透性及转移性之间的关系。研究表明Twist与Vimentin在食管癌，尤其是转移的食管癌中过表达，而E-cadherin在食管鳞癌中的表达则下调，初步表明Twist通过下调E-cadherin作为肿瘤侵袭和转移的启动子。Lee等[9]于2012年用免疫组化和反转录聚合酶链反应检测了199例食管癌样本中Twist的表达，并用组织样本和体外模型分析了Twist和食管癌EMT之间的相关性，结果表明Twist与食管癌的EMT显著相关，并且有可能作为食管癌诊断和预后的分子标志物。Sasaki等[10]在食管鳞癌的患者中检测Twist和E-cadherin的表达以及它们的预后价值，结果发现Twist的高表达和E-cadherin的低表达与肿瘤侵袭的深度、淋巴结转移、远程的节点转移、临床分期以及预后差显著相关，并且Twist的高表达与E-cadherin的低表达显著相关。目前还有很多研究发现在食管鳞癌中Twist蛋白的表达与E-cadherin的表达呈显著负相关，提示Twist蛋白可能通过上游调控造成E-cadherin表达降低或缺失是发生EMT的关键机制,从而增强肿瘤细胞的侵袭力和转移力[11-13]。

3 Twist与食管癌血管生成

近年来对肿瘤血管生成的研究表明，血管生成在肿瘤的生长、恶化和转移等方面起着很重要的作用。血管表皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作为最重要的血管内皮生长因子之一，可以促进血管内皮细胞的增殖，增强血管的通透性，还可以介导内皮细胞的浸润和迁移。在大多数恶性肿瘤中，VEGF的表达均升高，并且诱导肿瘤血管的生成。赵杰等[14]研究发现在食管鳞癌临床组织样本中Twist与VEGF的表达成正相关，提示Twist蛋白可能通过VEGF介导肿瘤血管生成，在食管鳞癌的生长、转移等方面发挥重要作用。Gong等[15]的研究进一步验证了食管鳞癌的临床组织样本中Twist与VEGF-C共表达,并且发现过表达Twist后食管鳞癌细胞的侵袭能力和VEGF-C的表达上调。这项研究表明Twist在食管鳞癌的淋巴结转移中通过增强VEGF-C的表达从而促进淋巴结转移。然而关于Twist与食管癌的血管生成的更直接的证据目前还没有相关文献报道，现有的关于Twist与血管生成的直接证据在肝癌及乳腺癌中均有过相关研究，研究发现上调Twist表达后可以提高肿瘤血管流量和血管渗透性[16]。

4 Twist与食管癌的浸润和转移

肿瘤的转移是一个较为复杂的过程，在此过程中需要不同的基因和信号通路来参与调控。目前肿瘤的转移包括如下几个步骤:①肿瘤细胞从原发性肿瘤病灶中分离，在此步骤中细胞需要经历EMT来获得分离的能力；②侵入周围组织，穿透基底膜，进入血管或者淋巴管，各种蛋白溶解酶和趋化因子起着关键作用；③在失巢凋亡情况下存活；④移出或渗出血管或淋巴管；⑤形成微型转移结节；⑥适应周围基质环境，经过EMT重新获得上皮细胞增殖特性，形成转移灶。

目前很多研究表明Twist在食管癌的浸润和转移中起着重要作用。Gong等[15]研究发现细胞核中Twist的表达与食管癌的淋巴结转移紧密相关。首先通过免疫组化检测发现Twist在转移的食管鳞癌组织中的表达要显著高于非转移的食管鳞癌组织，其次在建立的高转移的食管鳞癌细胞系中检测到Twist高表达。研究表明Twist可以促进食管癌的淋巴结转移。贺波等[17]采用免疫组化染色方法检测Twist在58例食管癌及对应癌旁组织表达情况，并分析其细胞亚定位与患者性别、年龄、肿瘤位置、TNM分期、淋巴结转移等临床资料的关系。结果表明Twist在食管癌细胞浆及细胞核中表达水平均显著高于癌旁组织(P<0.01),Twist在食管癌细胞核中的高表达与患者TNM分期及淋巴结转移密切相关(P<0.01)，而与患者性别、年龄及食管癌位置无显著相关性(P>0.05)。目前还有很多研究分析了Twist的表达与食管鳞癌临床病理资料之间的相关性，发现Twist的表达与食管鳞癌的临床分期、淋巴结转移及肿瘤的浸润深度均显著相关，这些发现进一步验证了Twist参与了食管癌的浸润和转移[12，14,18-20]。

5 Twist与食管癌的细胞凋亡

肿瘤作为一种细胞周期异常疾病，具有增殖失控和凋亡抑制的基本特征。相关研究表明Twist通过抑制p300/CBP相关因子(p300/CBP-associated factor，PCAF)来调控p53转录活性，使p53失去调控细胞凋亡的功能，从而促进肿瘤及肿瘤血管生长等生物学功能[7,21]。另外Twist还可通过改变成纤维细胞的特性，抑制可变读框基因(alterative reading frame，ARF)/双微体(murine double mimute2，MDM2)/p53，增强抗细胞凋亡作用。研究发现Twist对p53途径的作用主要表现在转录和翻译两个层次[7,21-22]。Twist抑制ARF的表达影响p53稳定性以及抑制p53分子结构中20位的丝氨酸(Ser20)的自身磷酸化，从而使p53介导的细胞凋亡途径失活；另外通过与p53反式作用因子HOXA5的相互作用，减少p53对Twist转录活性的抑制作用；同时Twist还通过抑制p300介导的乙酰化，阻止p53、p300和MDM2形成三元络合物，间接抑制p53介导的基因转录。有相关研究还表明Twist可以绑定p53 C-末端来阻滞p53转录后调控及MDM2介导的降解，发挥促进肿瘤进展的重要作用[22]。

目前有相关研究通过检测食管癌患者的癌组织、癌旁组织和正常食管组织中Twist、p53、E-cadherin蛋白表达水平,探讨了Twist蛋白表达与食管癌临床病理参数的关系，并分析了Twist与p53、E-cadherin蛋白表达的相关性[23]。结果表明食管癌组织中p53表达水平显著高于癌旁组织和正常食管组织,并且在不同的浸润深度、TNM分期、肿瘤分化程度和有无淋巴结转移的食管癌组织中p53蛋白表达具有显著差异,同时发现食管癌组织中Twist表达水平与p53之间存在明显的正相关性,表明食管癌中Twist可能通过诱导p53基因突变,使其失去抗癌作用从而参与食管癌的发生和发展,同时可能通过其他p53非依赖性通路抑制细胞的凋亡。这项研究表明Twist可能通过调节ARF/p53途径抑制细胞凋亡促进肿瘤细胞形成,同时影响E-cadherin的表达而促进EMT现象,参与食管癌的发生和转移。

6 Twist与食管癌的预后

Twist被认为是肿瘤细胞中促进转移和诱导EMT的关键因子。在很多肿瘤中都报道过Twist参与了肿瘤的进展和转移，然而关于Twist和肿瘤预后的相关性却仍旧存在争论。Wushou等[24]用系统回顾和Meta分析法来鉴定Twist的表达是否和肿瘤患者的预后存在相关性。这个研究包含了17个实验：肺癌4个、头颈癌3个、乳腺癌2个、食管癌2个、肝癌2个、骨肉瘤，膀胱癌，宫颈癌和卵巢癌各1个，共2 006例患者。结果表明Twist的表达与3年和5年生存率较差相关，与Twist的表达和肿瘤预后较差相关。另外Sasaki等[10]在166例食管鳞癌患者原发肿瘤外科手术样本中用免疫组化检测了Twist的表达和临床病理资料及预后的关系，研究发现Twist高表达和低表达组5年生存率有显著差异，同样的高表达E-cadherin组和低表达E-cadherin组5年生存率也有显著差异，并且高表达Twist和低表达E-cadherin的5年生存率要比低表达Twist高表达E-cadherin组的5年生存率要差。目前有很多研究表明Twist可以作为食管癌预后的分子标志物[25-27]。

7 展望

Twist作为一种重要的促癌基因，与食管癌的发生、浸润、转移以及预后密切相关。但目前关于Twist调控食管鳞癌淋巴转移的分子机制以及Twist相关的信号通路都还不清楚，不过随着Twist与肿瘤关系的研究这些问题终将得到解决。鉴于Twist在食管癌侵袭和转移过程中的特定作用，我们可以通过靶向Twist从而阻止食管癌浸润的发生及转移灶的形成，为患者治疗提供新的理论依据。