DISC1基因对神经干细胞生长发育及癫发生机制研究

吴文悦 吴倩 肖文彪 龙泓羽 肖波

精神分裂症断裂基因1（DISC1）是与精神分裂症、双相情感障碍、重度抑郁症等精神病相关的易感基因［4］，编码DISC1蛋白，在生物体各生长发育时期均有表达。DISC1蛋白作为支架蛋白，与多种蛋白质相互结合共同调控生物体生理功能。研究显示，DISC1基因在成人脑组织特别是海马齿状回神经发生与发育方面，如神经元增殖、迁移、分化、成熟和突触可塑性等具有重要作用［5］。DISC1基因表达变化可以导致新生神经元异常增殖、过度迁移、异常整合，并出现生理功能紊乱［5］。这些现象与癫发作后的病理生理改变存在诸多相似之处，提示DISC1蛋白可能与癫的发生与发展具有重要联系。中南大学湘雅医院肖波教授研究团队就DISC1基因及其相关蛋白对神经干细胞（NSCs）生长发育和癫发生发展的调控作用机制进行初步探讨［6⁃7］，现将主要方法和结果进行综述。

1.DISC1 mRNA和蛋白表达变化 免疫组织化学染色，DISC1蛋白广泛分布于正常小鼠海马组织，主要表达于神经元胞膜和胞质。两组小鼠DISC1蛋白在海马组织的分布区域无明显差异，对照组各时间点海马齿状回和CA3区DISC1蛋白水平差异无统计学意义（P＞0.05）；实验组癫持续状态后3天海马齿状回和CA3区DISC1蛋白水平与对照组差异无统计学意义（P＞0.05），至癫持续状态后7天低于对照组（P＜0.05），且随着时间的延长，DISC1蛋白水平下降。qRT⁃PCR法显示的癫持续状态后海马组织DISC1 mRNA表达变化与免疫组织化学染色相一致。Western blotting法显示，实验组小鼠癫持续状态后7、14和28天海马组织DISC1蛋白水平均显著低于对照组（P＜0.01）［6］。

2.DISC1蛋白与MCM2蛋白 MCM2蛋白是基因复制相关蛋白，存在于细胞核，是目前临床常用的检测人类和哺乳动物新生神经元的标志物［8］。MCM2蛋白在静止期细胞中基本不表达，在正常增殖细胞中于G0期开始表达，至S期早期达峰值水平，并与染色质结合，一旦DNA复制完成，即从染色体脱离，MCM2蛋白在G期和M期水平降低。由于MCM2蛋白在细胞增殖周期中的特异性变化，目前已经成为增殖细胞标志物［9⁃10］。我们研究团队发现，免疫组织化学染色显示，对照组小鼠MCM2蛋白主要表达于海马神经元胞核，MCM2阳性细胞局限于颗粒细胞层与门区之间的颗粒细胞下层，通常不超过颗粒细胞层内1/3，亦可见少量MCM2阳性细胞表达于门区和颗粒细胞层中1/3；对照组小鼠各时间点海马齿状回MCM2阳性细胞数目差异有统计学意义（P＜0.05），且随着时间的延长，MCM2阳性细胞数目逐渐减少，表明新生神经元减少，实验组小鼠癫持续状态后3、7、14和28天海马齿状回MCM2阳性细胞数目均高于对照组（P＜0.05），且随着时间的延长，这种差异更加明显；qRT⁃PCR法显示，实验组小鼠癫持续状态后 3、7、14和 28天 MCM2 mRNA含量均高于对照组（P＜0.05），表明癫发作后海马齿状回出现新生神经元的神经前体细胞增殖；采用Pearson相关分析探讨DISC1蛋白与MCM2蛋白水平的相关性，二者呈正相关关系（r=0.756，P＜0.001）［6］。由此可见，正常成年哺乳动物海马齿状回存在神经发生现象，且随着年龄的增长，神经发生逐渐减少。某些病理因素如癫可以激活神经前体细胞，导致神经发生增加。

3.DISC1蛋白与DIXDC1蛋白 DIXDC1基因编码蛋白含丝氨酸和苏氨酸位点，可以被蛋白酪氨酸激酶（PTK）糖原合成酶激酶⁃3β（GSK⁃3β）磷酸化，参与Wnt信号转导通路，在胚胎神经发育、神经元分化和轴突生长中发挥重要生物学作用［11⁃12］。DIXDC1蛋白广泛表达于成年小鼠脑组织，在海马组织中主要表达于CA1～CA4区和齿状回颗粒细胞层［13］。Singh 等［14］发现，DIXDC1 蛋白与 DISC1 蛋白存在相互作用，他们在胚胎14天小鼠脑组织中发现DIXDC1蛋白与DISC1蛋白共沉淀，且二者相互结合，对 Wnt/GSK⁃3β/β⁃连环蛋白（β⁃catenin）/T细胞因子（TCF）/淋巴样增强因子（LEF）信号转导通路发挥共调节作用。我们研究团队发现，免疫组织化学染色显示，DIXDC1蛋白主要表达于齿状回颗粒细胞层神经元胞质，实验组小鼠癫持续状态后 3、7、14和28天海马齿状回DIXDC1蛋白水平均低于对照组（P＜0.01），且随着时间的延长，DIXDC1蛋白水平下降；qRT⁃PCR法和Western blotting法显示的海马组织DIXDC1蛋白表达变化与免疫组织化学染色相一致；Pearson相关分析显示，实验组小鼠海马组织DIXDC1蛋白与DISC1蛋白水平呈正相关关系（r=0.808，P＜0.05），DIXDC1 mRNA与MCM2 mRNA转录水平呈正相关关系（r=0.488，P ＜ 0.05）［6］。由此可见，DIXDC1基因和DISC1基因在癫发生与发展中存在某种联系，DIXDC1基因可能与神经干细胞增殖有关。

4.DISC1蛋白与PDE4蛋白和PDE4B蛋白

PDE4蛋白是特异性cAMP水解酶，是磷酸二酯酶（PDE）家族最大成员，包括PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D共4种亚型，尤以PDE4B蛋白在脑组织中水平最高。PDE4蛋白在神经系统各类细胞中均有不同程度表达，发挥调节神经系统活动的重要作用。PDE4/cAMP信号转导通路参与多种病理生理学过程，如突触发生、突触后神经传递、新生神经元异常增殖等［15⁃17］。研究显示，DISC1 蛋白与 PDE4 蛋白存在联系，但其相互作用机制较为复杂，目前尚不十分清楚［18］，关于 PDE4蛋白在癫发生机制中的作用研究较少。我们研究团队发现，免疫组织化学染色显示，PDE4蛋白广泛分布于正常小鼠海马组织，尤其CA1～CA3区锥体细胞、门区中间神经元和齿状回颗粒细胞均可见PDE4阳性细胞，主要表达于神经元胞膜和胞质，且其表达水平在各时间点无明显差异；实验组小鼠癫持续状态后3和7天海马齿状回和CA3区PDE4水平与对照组无明显差异（P＞0.05），至癫持续状态后14天低于对照组（P＜0.05），而至癫持续状态后28天又高于对照组（P＜0.05），PDE4B蛋白表达变化与PDE4蛋白相一致，在实验组小鼠海马齿状回和CA3区呈现先下降后上升的趋势；qRT⁃PCR法显示的PDE4 mRNA和PDE4B mRNA表达变化与免疫组织化学染色相一致［6］。为何 PDE4蛋白和PDE4B蛋白在癫动物模型中呈现如此趋势？它们通过何种作用机制影响癫的发生与发展？我们研究团队认为，DISC1蛋白与PDE4蛋白的结合和解离受多种因素的影响，包括分子亚型、表达水平、结合位点亲和力等［6］。由于相对分子质量为71×103的DISC1蛋白氨基酸含量不确定，故一些结合位点可能消失，使解离更加容易。我们研究团队发现，随着时间的延长，癫模型小鼠海马组织DISC1蛋白水平逐渐下降，而PDE4蛋白水平先下降后上升［6］。究其原因可能是DISC1蛋白与PDE4蛋白结合后，PDE4蛋白表达下调、活性降低，cAMP水平随之升高，当cAMP水平升高至一定程度时，促使DISC1蛋白与PDE4蛋白解离，解除对PDE4蛋白的抑制，使PDE4蛋白水平升高；当DISC1蛋白降低至一定程度，结合的PDE4蛋白水平下降，DISC1蛋白对PDE4蛋白的抑制减弱，使PDE4蛋白表达上调［19］，推测如果DISC1蛋白与PDE4蛋白之间的联系发生变化，可以导致cAMP信号转导通路异常。DISC1蛋白可能通过与PDE4蛋白相互作用以调节cAMP信号转导通路，从而参与癫的发生与发展过程。

二、体外神经干细胞研究

为进一步探讨DISC1基因对神经干细胞增殖、迁移、细胞周期和凋亡的影响，并探寻DISC1基因相关神经元生长发育基因，我们研究团队从C57BL/6胎鼠海马组织中分离、提取并培养原代神经干细胞，通过构建过表达DISC1基因的重组逆转录病毒载体胞嘧啶⁃腺嘌呤⁃鸟嘌呤（CAG）⁃DISC1和沉默DISC1基因的小干扰RNA（siRNA）成功制备DISC1基因过表达模型和DISC1基因敲除模型［20］。

1.DISC1基因对神经干细胞功能的影响 我们研究团队分别于模型制备后即刻、24、48和72小时采用MTS法、Transwell小室模型和流式细胞术检测DISC1基因过表达模型和DISC1基因敲除模型神经干细胞增殖、迁移、细胞周期和凋亡情况［20］。MTS法显示，DISC1基因敲除模型中，DISC1 siRNA转染24、48和72小时后，神经干细胞增殖抑制率较空载对照组升高5.73%、22.00%（P＜0.01）和23.27%（P＜0.05）；CAG⁃DISC1感染24、48和72小时后，神经干细胞增殖抑制率较空载对照组降低10.64%（P＜0.05）、15.21%（P ＜ 0.01）和 19.60%（P ＜ 0.05）［20］。Transwell小室模型计数细胞数目，DISC1基因敲除模型中实验组穿过膜孔的神经干细胞数目少于对照组［（53.50±7.15） 个对（90.67±6.77） 个，P ＜0.05］；DISC1基因过表达模型中实验组穿过膜孔的神经干细胞数目高于对照组［（53.67±9.67）个对（34.83±5.19）个，P ＜ 0.01］［20］。流式细胞术检测细胞周期，DISC1基因敲除模型中实验组神经干细胞生长受到抑制，处于G0期/G1期、S期和G2期/M期的细胞比例为 64.20%、22.33%和13.47%，低于空载对照组的 44.16%（P＜0.01）、39.65%（P＜0.01）和16.19%（P＜0.01）；DISC1基因过表达模型中实验组细胞生长较活跃，处于G0期/G1期、S期和G2期/M期的细胞比例为43.50%、39.63%和16.87%，高于空载对照组的 41.47%（P＜0.01）、32.31%（P＜0.01）和26.22%（P ＜ 0.01）［20］。流式细胞术检测细胞凋亡，DISC1基因敲除模型中实验组凋亡细胞比例较空载对照组高7.48%（P＜0.05）；DISC1基因过表达模型中实验组凋亡细胞比例与空载对照组差异无统计学意义（P ＞0.05）［20］。由此可见，DISC1基因对神经干细胞的增殖和迁移具有正向调节作用，可以促进神经干细胞生长，但对神经干细胞的凋亡作用不显著。

2.DISC1基因及神经元生长发育相关基因 为探讨DISC1基因对神经干细胞生长发育的作用及其机制，我们研究团队采用神经元发生相关聚合酶链反应（PCR）检测DISC1基因过表达模型和DISC1基因敲除模型中神经元生长发育相关基因表达变化，结果显示，DISC1基因敲除模型中，与对照组相比，Neurog1、Neurog2、Nr2e3和 Sox2基因表达下调（均P ＜0.01），而 Dll1、Pafah1b1和 Pax5基因表达上调（均P＜0.01）；DISC1基因过表达模型中，与对照组相比，Dll1、Dvl3、Pax3和Pax5基因表达下调（均P＜0.01），Neurog2、Pafah1b1、Sox2、Sox3和Stat3基因表达上调（均P＜0.01），表明DISC1基因对神经干细胞生长发育的调控可能与多种基因（Dll1、Dvl3、Neurog1、Neurog2、Nr2e3、Pafah1b1、Pax3、Pax5、Sox2、Sox3和Stat3）及其产物有关，其中，两种模型中与DISC1基因表达变化趋势相一致的是Neurog2和Sox2基因，相反的是Dll1和Pax5基因，提示上述4种基因可能是DISC1蛋白调节系统中的潜在下游作用分子［20］。我们研究团队进一步选择表达变化最为显著的Sox2和Pax5基因，探究二者协同作用对神经干细胞增殖和迁移的调节作用。Sox2基因是多系干细胞，尤其是神经干细胞自我更新的重要因素［21］，在转录水平上调或下调时均可以导致干细胞生长发育失衡［22］。研究显示，在多种生长增殖活跃的细胞中Sox2基因表达均上调，若将Sox2基因敲除，细胞则停止增殖［23⁃25］。Pax5 基因位于第 9 号染色体短臂13区，编码B细胞特异性活化蛋白（BSAP），后者与B淋巴细胞增殖密切相关［26］。近年有文献报道，Pax5基因及其产物可能参与神经系统生长发育的调节。Adams等［27］的研究显示，Pax5基因与Pax基因家族其他成员不同，可在中枢神经系统发育过程中持续表达，在中脑和脊柱发育过程中短暂表达。我们研究团队通过在DISC1基因敲除模型中沉默Pax5基因或过表达Sox2基因以及在DISC1基因过表达模型中过表达Pax5基因或沉默Sox2基因，采用MTS法和Transwell小室模型分别检测神经干细胞增殖、迁移变化，结果显示，在DISC1基因过表达模型中敲除Sox2基因或在DISC1基因敲除模型中过表达Sox2基因，神经干细胞增殖和迁移能力均部分恢复，而在DISC1基因过表达模型中过表达Pax5基因或在DISC1基因敲除模型中敲除Pax5基因，神经干细胞增殖和迁移能力并无部分或完全恢复，反而使原有的增殖和迁移能力缺陷加重，推测不同于Sox2基因作为DISC1基因的下游作用分子，与DISC1基因共同调控神经干细胞的增殖和迁移能力，Pax5基因对神经干细胞增殖和迁移能力可能有独立调控机制［20］。由此可见，DISC1基因与Pax5基因或Sox2基因共同对神经干细胞增殖和迁移能力发挥调控作用，其中，Sox2基因是DISC1基因的下游作用分子，Pax5基因独立于DISC1基因，直接对神经干细胞增殖和迁移能力产生应答效应。

三、总结与展望

DISC1基因在神经发生中具有重要作用，但其对神经细胞的调控作用十分复杂。大部分情况下，DISC1蛋白表达缺失可以导致神经干细胞迁移能力缺陷。既往在斑马鱼和啮齿类动物实验中发现，胚胎大脑发育期DISC1蛋白对神经前体细胞的增殖和迁移呈正向调控作用，即DISC1蛋白水平升高时，神经前体细胞增殖和迁移能力增强，反之亦然［30⁃31］。我们研究团队在体外神经干细胞实验中亦发现，DISC1蛋白对神经干细胞增殖和迁移具有正向调控作用，并能促进神经干细胞生长［20］。DISC1蛋白在癫中的研究甚少，我们研究团队首次在匹罗卡品诱导小鼠癫持续状态模型中探讨DISC1蛋白表达变化，结果显示，DISC1蛋白水平下降可以导致神经发生［6］，并经多项研究所证实。有学者采用逆病毒介导的单细胞RNA干扰（RNAi）技术使成年小鼠海马分裂期新生颗粒细胞DISC1蛋白水平下降，可以导致细胞树突过度增长和异位树突形成；且DISC1蛋白水平下降的新生颗粒细胞较正常新生颗粒细胞存在过度迁移甚至异位现象，并表现为兴奋性增高［32］。尽管DISC1蛋白的调控作用复杂，但可以肯定的是，其与癫的发生与发展存在重要联系。

作为一种多功能“载构”蛋白，DISC1蛋白可以与200多种蛋白质相结合，参与众多信号转导通路，如细胞外信号调节激酶（ERK）通路、丝氨酸/苏氨酸激酶（Akt）通路［33］、GSK⁃3β/β⁃连环蛋白信号转导通路［34］、经典或非经典 Wnt通路［34］、γ⁃氨基丁酸受体（GABAR）通 路［35］和 N⁃甲 基 ⁃D⁃天 冬 氨 酸 受 体（NMDAR）通路［36］等，甚至直接对神经元生长发育发挥调控作用。我们研究团队初步发现，DISC1蛋白与DXIDC1蛋白、PDE4蛋白和PDE4B蛋白均存在相互作用［6］。既往研究证实多种DISC1蛋白网络成员的作用和功能，并发现其之间并非完全独立的，通过直接和间接物理连接或化学连接、信号转导通路间连接模式相互影响、彼此作用，形成一个以DISC1蛋白为核心的调控系统以发挥生物学作用。然而DISC1蛋白的结构和功能复杂，我们研究团队的工作仅是冰山一角，深入了解其具体作用途径和机制对了解癫的发生与发展及治疗具有重要意义。同时，DISC1蛋白是精神分裂症、焦虑、双相情感障碍等精神病相关蛋白，癫患者合并焦虑、抑郁等精神病的报道较为常见，因此推测，DISC1通路功能障碍可能是慢性癫患者发生焦虑、抑郁的原因，而抑制癫后异常神经发生可能对这些行为障碍有治疗作用。

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