晾晒烟调制过程中酶促棕色化反应及调控方法

李秀妮 ，乔保民 ，吴 创 ，田煜利 ，万德建 ，时向东

（1.河南农业大学，河南郑州450002；2.湖北省烟草公司恩施州公司，湖北恩施445000）

酶促棕色化反应是一系列复杂的生物化学反应，在晾晒烟的调制过程中，烟叶因饥饿代谢而消耗大量的内含物质，因此，外观颜色会随调制的进行不断发生改变，其颜色的变化为“淡绿—黄绿—淡黄—正黄—深黄—棕色—褐色”[1]。Akaike等[2]对日本烟草var.Shirodaruma在晾制过程中色素的变化进行了研究，在由绿变黄阶段，颜色发生变化的实质原因是在叶绿素的降解作用下发生酶促棕色化反应所致。适当促进酶促棕色化反应的进行，将有利于晾晒烟品质的提升，但若环境温湿度条件或烟叶失水速率控制不当，就极易使酶促棕色化反应发生过度，导致晾晒烟发黑、霉变、甚至腐烂，严重影响烟叶的外观质量和抽吸品质[3]。因此，如何调控酶促棕色化反应的进行对晾晒烟调制具有重要意义。

1 酶促棕色化反应的过程与本质

1.1 酶促棕色化反应过程

国外对酶促棕色化反应的研究始于20世纪70年代，国内开始于20世纪80年代，目前已经取得了很大的进展[4]。酶促棕色化反应主要发生在烟叶变黄末期至调制结束这一过程中。当调制进行至变黄末期，原本束缚于细胞内的氧化酶类随着叶肉组织逐渐死亡，细胞膜系统透性逐渐增大而渗入细胞间隙中，从而与细胞间隙内的多酚类物质发生直接接触，生成大量醌类物质。同时，细胞膜系统透性的增大使活性氧能自由进出烟叶组织，促使叶片内氧化酶（特别是多酚氧化酶PPO）的活性增强，从而促进细胞内多酚类物质的氧化[5－6]，叶片内最终物质的氧化还原平衡被破坏，醌类物质大量生成和聚合使烟叶颜色加深[7]。

1.2 酶促棕色化反应本质

Matheis等[8]研究表明，植物组织中的酚、酶一经接触，将会发生一系列反应。首先一元酚经甲酚酶催化生成邻－二羟基化合物，然后在多酚氧化酶的催化作用下，邻－二酚被氧化成邻－本醌，最后邻－本醌继续变化，生成高分子聚合物。此外，氨基酸或蛋白质与邻－苯酚作用生成高分子的络合物，这些物质会导致褐色素的生成。例如，在晾晒烟调制和发酵过程中儿茶酚棕色化反应就是烟叶变褐的重要过程[9]。在这个过程中，首先儿茶酚在多酚氧化酶作用下氧化成邻醌，随后邻醌或没有氧化的儿茶酚在酚羟化酶催化下进行第二次羟基化作用，生成三羟基化合物；邻醌具有强氧化能力，能将三羟基化合物氧化成羟基对醌或羟基邻醌，此反应无需酶参加；羟基醌容易聚合，这是主要的褐变反应，且随着聚合度的加大，颜色由红变褐，最终产生褐色的黑色素。所以，酶促棕色化反应的实质在于烟叶中的酚类物质（如绿原酸、咖啡酸、芸香苷等）和自身为黄色的黄酮类物质在烟叶变黄过程中转化为多酚类物质，它们经过氧化产生淡红色乃至黑褐色的醌类物质，最终使烟叶颜色加深[10]。因此，烟叶的酶促褐变本质上是多酚氧化酶间接作用的结果[11]。

2 烟叶调制阶段酶促棕色化反应发生的条件及影响因素

2.1 外在因素

烟叶调制时诱导酶促棕色化反应发生的外部环境因素主要有两个，一是调制温度，二是环境相对湿度，两者共同影响烟叶内的水分含量和烟叶内酶的活性，进而影响棕色化反应的发生[12]。一般来说，当调制环境的相对湿度高于60%，温度在45～46℃且烟叶失水量少于50%时，将导致酶促棕色化反应的发生。但是，即使水分含量较高的新鲜烟叶，在此温度范围内，只要环境相对湿度控制在60%以下，烟叶在变黄末期的失水量大于50%，则棕色化反应就不易发生[11]。

2.2 内在因素

2.2.1 变黄后期烟叶组织含水量 烟叶的生命活动状态是保证酶促棕色化反应进行的必要条件[13]，而烟叶生命活动的强弱是由叶片水分状况决定的[14]。因此，当叶片处于变黄末期时，烟叶中的含水量直接决定了能否发生酶促棕色化反应[15]。若变黄阶段失水量过少，则烟叶黄而僵硬，在后期调制阶段随着温度的上升，极易发生酶促棕色化反应。若失水量适当，则酶活性得到抑制，酶促棕色化反应即可得到有效控制[16]。

2.2.2 烟叶组织细胞结构的完整性 随着调制过程的不断进行，组织细胞结构被破坏[17]。细胞内的各种物质与酶类混合在一起相互作用，促使酶促棕色化反应发生。细胞结构被破坏使氧分子能自由进出细胞，氧化酶类活性增强，酶促棕色化反应速度加快[18]。所以，细胞结构破坏的速度和程度直接影响了酶促棕色化反应进行的速度和进程。

2.2.3 烟叶组织细胞多酚氧化酶（PPO） 活性多酚氧化酶（PPO）作为酶促棕色化反应的介导物，其活性的大小直接影响该反应的速度[11]。酶活性大小与细胞内能自由进出氧分子量的多少成正相关，也与温度有直接关系。一般温度低时，多酚氧化酶（PPO）活性较低，但随着温度升高，活性有上升趋势。若在温度升高的同时，配合相对湿度的降低，则多酚氧化酶活性会随着调制时间的延长而逐渐降低[19]。

3 晾晒烟叶调制过程中酶促棕色化反应的调控

3.1 多酚氧化酶（PPO）活性的调控

3.1.1 温度与相对湿度 一般来说，温度对多酚氧化酶（PPO）的活性影响主要在以下两个方面：一方面当温度在45～50℃、相对湿度60%以上时随着温度的升高，酶活性降低；另一方面在温度55℃、相对湿度60%以下时随着温度的升高，活性酶的比例下降[20]。因此，多酚氧化酶（PPO）最终的活性大小是由这两方面综合作用决定的。除温度外，烟叶内水分含量对多酚氧化酶（PPO）活性大小也是至关重要的。在变褐期调制房内温度为16～32℃，湿度控制为65%～75%条件下进行调制可获得较理想的效果[21]。雷东锋等[22]通过对烟叶水分含量与多酚氧化酶（PPO）活性关系的分析发现，烟叶水势条件为－872.78 kPa时，多酚氧化酶（PPO）活性最高。因此，要想进行适宜的酶促棕色化反应就应该在烟叶调制过程中对其环境温度和相对湿度进行相应的技术调控。

3.1.2 环境pH值 酸碱度是酶赖以生存的环境条件，每种酶只有在其适宜的pH值范围内才表现出应有的活性。戴亚等[23]研究指出，引起酶促褐变的适宜pH值范围在4～7之间，降低或提高介质中的pH值，可以控制多酚氧化酶（PPO）活性。韩富根等[24]研究表明，在18～20℃条件下，烟叶中多酚氧化酶（PPO）在pH值为6.0时活性较强，在偏碱条件下，酶活性下降较快。在烟叶晾制过程中，若在调制房内放置具有一定酸碱度的Ca、K、Mg盐溶液即可调节pH值。

3.1.3 激活剂和抑制剂 CuCl2对多酚氧化酶（PPO）具有激活作用。铜离子有增强酶活性的功能，是烟草多酚氧化酶的良好激活剂。雷东锋等[22]研究表明，当铜离子浓度在 0.1～1.0 mmol·L－1浓度范围内，多酚氧化酶（PPO）活性净增长百分率随Cu2+浓度增加而增加，但增长幅度逐渐趋于平缓。李荣林等[25]对该酶性质进行了系统研究时发现，将该酶的最适温度上升至40℃，最适pH值上移至7.0，酶对金属离子的适应性增强，对抑制剂敏感性下降。多个试验表明，在相同浓度下CuSO4对多酚氧化酶抑制作用最强，其次是EDTA、对苯二酚、巯基乙醇和硫脲[26－28]。

3.2 环境氧气浓度的调控

烟叶酶促棕色化反应发生的一个重要条件是氧气的参与[29]，通过对调制房氧气浓度的控制可有效调控该反应进行的速度。有研究指出，在烟叶调制过程中，当环境氧气体积分数（浓度）高于5 000×106时，随着氧气浓度的增加烟叶褐变程度逐渐加重[30]。但当环境氧气体积分数（浓度）在100×106时，酶促褐变基本上不会发生。因此，降低调制环境中氧气的浓度可有效减少棕色化反应的发生。另有研究发现，如果人为改变调制环境中气相成分的组成比例（比如人工填充氮气和二氧化碳），降低烟叶周围氧气浓度，则能抑制多酚氧化酶（PPO）的活性[31]。范坚强等[32]通过对密封烟垛进行降氧处理，在一定程度上抑制了酶促棕色化反应的发生。

4 展 望

目前，酶促棕色化反应对烟叶感官质量和外观质量的意义已被广泛认可[11]，而非酶促棕色化反应理论则常应用于白肋烟的高温处理和烟丝加香加料中以改善烟叶品质[33]。因此，如何合理地进行调控是烟草科技工作者不懈努力和关注的问题。现阶段，调制过程中的调控方法一般都从控制氧气浓度、调节多酚氧化酶（PPO）活性两方面来进行。虽已取得了较好的效果，但都还存在一定的局限性。仅从这两方面入手，一方面资源投入量较大，经济成本较高，另一方面，需要消耗大量的人力劳动。因此，如何探索出更加简单高效且经济的调控方法是所有烟草研究者共同努力的目标。

有研究表明，植物自身存在某些可打破多酚氧化酶（PPO）潜伏状态的激活剂，如菠菜中的亚麻酸、蚕豆中的游离脂肪酸等[34]。同样，多酚氧化酶（PPO）的天然抑制剂也存在，如茶叶中的白花青素、橡黄素、菠菜叶中的草酸盐等[35]。笔者认为，烟叶自身也很有可能存在多酚氧化酶（PPO）激活剂和抑制剂，在调制过程中通过对环境的适当调控使激活剂和抑制剂适当表达，或者通过基因调控手段对多酚氧化酶（PPO）表达进行调控，将会对酶促棕色化反应起到调控作用，有利于晾晒烟品质的提升。因此，探索晾晒烟自身多酚氧化酶（PPO）表达以及采用天然激活剂和抑制剂的调控方法，是进一步调控酶促棕色化反应提高烟叶质量的方法，并且也将是今后探索的方向。

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