紫草油对肛瘘术后组织修复及TGF—β1和Smad3表达的影响

赵诚 王未娟

[摘要]目的 通过研究肛瘘术后TGF-β1和Smad3因子的表达变化，了解紫草油促进创面愈合的机制。方法 选取2017年3月～2018年3月我院收治的90例肛瘘患者作为研究对象，按照简单随机方法分为紫草油组（30例）、肤痔清组（30例）与凡士林组（30例）。紫草油组采用紫草油外用方法，肤痔清组采用肤痔清外用，凡士林组采用凡士林外用。利用RT-PCR 和Western-blot检测比较三组的TGF-β1和Smad3因子的表达情况。结果 RT-PCR 和Western-blot表明，紫草油组TGF-β1含量逐渐升高。治疗后第21天，紫草油组中TGF-β1含量高于肤痔清及凡士林组，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗后第21天，紫草油组中Smad3含量低于肤痔清及凡士林組，差异有统计学意义（P<0.05）；同时紫草油组的愈合时间也短于其他两组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 紫草油能够有效促进肛瘘术后创面愈合，可能是通过上调TGF-β1含量及下调Smad3含量来调控的。可为紫草油治疗湿热下注型肛瘘术后提供了初步的理论基础。

[关键词]肛瘘；紫草油；TGF-β1；Smad3

[中图分类号] R657.1+6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）10（a）-0004-05

[Abstract] Objective To explore the mechanism of Arnebia Root Oil promoting wound healing by studying the expression changes of TGF-β1 and Smad3 factors after anal fistula surgery. Methods A total of 90 anal fistula patients admitted to our hospital from March 2017 to March 2018 were enrolled in this study. They were divided into the Arnebia Root Oil group （n=30）， Fuzhiqing group （n=30） and Vaseline group （n=30） according to the simple random method. In the Arnebia Root Oil group， Arnebia Root Oil was used， while in the Fuzhiqing group， Fuzhiqing for external application was used， and in the Vaseline group， Vaseline for external application was adopted. Expression of TGF-β1 and Smad3 factors among three groups was compared and detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） and Western blot. Results RT-PCR and Western blot showed that the content of TGF-β1 in the Arnebia Root Oil group increased gradually. On the 21st day after treatment， the content of TGF-β1 in the Arnebia Root Oil group was higher than that in the Fuzhiqing and Vaseline groups with statistical significances （P<0.05）. On the 21st day after treatment， the content of Smad3 in the Arnebia Root Oil group was lower than that in the Fuzhiqing and Vaseline groups， which differed statistically （P<0.05）. Meanwhile， the healing time in the Arnebia Root Oil group was shorter compared with that of the other two groups （P<0.05）. Conclusion Arnebia Root Oil can effectively promote wound healing after anal fistula surgery， which may be regulated by TGF-β1 up-regulation and Smad3 down-regulation， thus providing a preliminary theoretical basis for Arnebia Root Oil treatment after anal fistula surgery identified as a damp-heat pouring downward pattern.

[Key words] Anal fistula； Arnebia Root Oil； TGF-β1； Smad3

肛瘘是肛管直肠与肛门周围皮肤相连通的一种病理通道，是肛周脓肿的慢化阶段，其临床表现特点主要为肛门硬结、压痛、反复局部流脓、潮湿及瘙痒。紫草油多年临床验证它能促进创面愈合，然其作用机制不明。TGF-β1/Smad3信号转导通路在创面修复过程扮演着重要的角色。所以为阐明紫草油的作用机制，本实验以TGF-β1和Smad3因子为研究对象，检测TGF-β1和Smad3 因子表达水平的变化。

1资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2017年3月～2018年3月收治的90例肛瘘患者作为研究对象，均签署知情同意书。本研究已经医院医学伦理委员会审核批准。按照简单随机方法分为紫草油组（30例）、肤痔清组（30例）与凡士林组（30例）。紫草油组中，男19例，女11例；平均年龄（45.22±11.01）岁。肤痔清组中，男17例，女13例；平均年龄（43.02±10.21）岁。凡士林组中，男18例，女12例；平均年龄（44.62±09.51）岁。三组的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性

1.2 诊断及入选标准

按照2006年出版的《肛瘘临床诊治指南（2006版）》[1]，选取低位单纯性肛瘘作为研究对象。所有病例均在局麻下行“肛瘘切开术”。

1.3研究方法

1.3.1 血清的提取 各实验组于手术后第1、7、14、21天次日抽取外周静脉血3～5 ml，离心机离心后吸取上层血清至1.5 ml EP管保存。

1.3.2 RT-PCR法 按试剂盒操作程序提取总RNA并检测，之后进行RT-PCR实验。目的基因引物： TGF-β1上游引物序列为5′-AAGGACCTGGGTTGGAAGTG-3′，下游引物序列为5′-CCGCTTCCTTTGTCCATCAG -3′（扩增产物长度：381 bp）。Smad3基因的上游引物序列为5′-AGTTTGACGGTGAGCTGGTA-3′，下游引物序列为5′-GCCTCGGCCTGCCGCAAGCCT-3′（扩增产物长度：364 bp）。内参GAPDH序列为：上游5′-CACCGGGAAACCCATCACCA-3′，下游为5′- ACGCC AGTAGACTCCACGACAT -3′（擴增产物长度：96 bp）。PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldViewTM染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

1.3.3 Western-blot法 裂解液提取总蛋白后取等量总蛋白。电泳分离后用PVDF膜进行转膜。将TGF-β1和Smad3一抗用封闭液稀释1000倍；将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反应过夜。然后将二抗用1×TBST稀释3000倍，将一抗反应膜放入二抗中作用60 min。ECL试剂盒显色，拍照，采用美国UVP分析仪器，对胶片进行扫描，比较各组灰度变化

1.4统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件对数据进行分析处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两样本之间采用t检验，多样本比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 TGF-β1和Smad3 mRNA在血清中的表达

TGF-β1 及Smad3 PCR扩增曲线显示，每条曲线均有明显的指数扩增期，表明PCR体系完好；TGF-β1 及Smad3 PCR产物的溶解曲线显示各扩增产物为特异性目的基因（图1～2）。

2.2三组术后不同时间TGF-β1和Smad3 mRNA相对表达水平的比较

经治疗，肛瘘术后三组TGF-β1 mRNA的表达水平均有所升高。术后第21天紫草油组中的TGF-β1 mRNA表达高于凡士林组、肤痔清膏组，差异有统计学意义（P<0.05）；同时术后第21天，紫草油组中的Smad3 mRNA表达低于凡士林组、肤痔清膏组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.3紫草油治疗肛瘘术后TGF-β1、Smad3 蛋白表达水平的影响

术后第21天，紫草油组TGF-β1蛋白表达水平明显高于凡士林组、肤痔清组，差异有统计学意义（P<0.05）。与之相反，Smad3 蛋白表达水平明显低于凡士林组、肤痔清组，差异有统计学意义（P<0.05）（图3、表2）。

2.4三组病例创面愈合时间的比较

紫草油组的创面愈合时间短于肤痔清组及凡士林组，差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。

3讨论

肛瘘是肛肠科常见疾病。肛瘘亦称为肛管直肠瘘，是一种异常管道[2]。国外有学者[3]报道，每十万人口有86人罹患肛瘘，平均年龄38.3岁，男女比例为1.8∶1.0，年龄<15岁的患者多为男性。手术是肛瘘的主要治疗方法，但由于特殊的病变部位，肛瘘术后一般不做缝合，创面大，容易感染，创面愈合缓慢，因此如何加快肛瘘术后创面修复就成为临床研究的热点[4-5]。中医外治是最古老的治法之一，尤其对肛肠疾病，中药制剂的外用能使药性直达病所，比内服更具有优势，故《医说源流》曰：“外科之证，最重外治”。肛门局部创面分泌物稠厚黄白等“湿”“热”的特点。除此之外，肛瘘术后，经脉受损，施术局部气血阻滞，与湿热相结，形成湿热蕴结，气滞血瘀的病理状态，采用清热利湿、活血化瘀、消肿止痛之中药，使湿热除，瘀血去，新血生，疮疡愈合。故如何运用清热利湿化瘀法于肛瘘术后关重要。

祖国医学认为通过中药外用，能够加速创面愈合，疗效明确。主要因为通过中药外用能促进组织周围的细胞释放相关生长因子，导致创面氧自由基的量和活性降低，进一步提高机体抗感染能力[6]。我院紫草油方以紫草为君，黄连为佐使。紫草味苦、甘，性寒。功效：活血、凉血、解毒透疹。《本草纲目》曰：“紫草，其功长于凉血活血，利大小肠。”紫草外用常调制成油膏，亦可以水浓煎用。治疗痈疽肿毒多用于溃后，或用于各种慢性溃疡，凡创面赤肿及渗出较多者用之可起清热消肿、减少渗出之功效，从而可生肌长肉，促进溃疡愈合。黄连味苦性寒，有清热、泻火解毒的功效。常用于湿热证等，又解毒疗疮.以治痈疽肿毒.口舌生疮等。二味共为君药共奏清热利湿、消肿止痛之功。

创面愈合就是一个复杂的修复过程，机体通过自身的再生能力，恢复创面表面的连续性和完整性。在这个复杂的生物学过程中，涉及多种组织和修复细胞、生长因子、细胞因子和胞外基质成分以及各种调控因素的共同参与。肉芽的主要成分是新生的毛细血管床和成纤维细胞[7]。创面愈合的主要修复细胞为成纤维细胞，直接影响胶原合成和分泌，而合成的胶原又是构成细胞外基质的主要部。研究也证实，TGF-β1/Smad 信号通路的调控作用与创面愈合是密不可分的[8]。

TGF-β1是创面修复过程中重要的细胞因子，TGF-β/Smad 信号通路重要的组成部分[9]。TGF-β1作为 TGF-β 细胞因子家族的一员，与创伤愈合紧密联系[10-11]。TGF-β1不仅是成纤维细胞的强效趋化因子，也是一种抗炎细胞因子[12]。主要作用于炎症及修复细胞，可产生细胞的趋化性迁移、抗炎等生物学效应[13]。此外TGF-β是刺激创面肉芽组织形成最有效的细胞因子之一，而这一诱生过程是可逆的，可增加伤口组织抗张强度和促使血管新生，对表皮有明显促进愈合作用。相关研究[14]提示，TGF-β1/Smad 信号通路对血管正常结构的维持有重要的作用。本实验研究中表明，三组药物干预均能上调TGF-β1 mRNA及蛋白的表达，但术后第21天紫草油组中的TGF-β1 mRNA及蛋白表达明显高于凡士林组、肤痔清膏组，差异有统计学意义（P<0.05），提示紫草油能有效促进肛瘘术后创面的愈合，与紫草油外用作用于创面后上调TGF-β1 mRNA有密切的关系。

Smad蛋白家族是细胞内重要的信号转导蛋白，直接参与TGF-β超家族成员TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3以及骨形态发生蛋白（BMP）等多个成员的信号传导[15]。Smad2与Smad3 属于共同介导性的Smad蛋白，是TGF-β1信号转导通路中特异的、起瓶颈作用的重要因子。然而真正反映TGF-β1/Smad3信号通路的激活水平与强度的是磷酸化Smad3 表达水平[16-17]。因此相关研究表明提高磷酸化 Smad2、Smad3 表达水平，可激活溃疡创面 TGF-β1/Smad3 信号通路，加速伤口的修复[18]。相关研究表明敲除Smad3后，促使Smad3 表达降低，创伤愈合明显加速[19]。本实验研究中表明，三组药物干预后Smad3表达逐渐下降。术后第21天紫草油組中的Smad3 mRNA及蛋白表达明显低于凡士林组、肤痔清膏组，差异有统计学意义（P<0.05），提示紫草油能通过下调Smad3因子的表达，进而有效促进创面的愈合。

综上所述，TGF-β1/Smad3信号通路可多方面调节细胞增殖、分化及纤维化等过程[20]。本实验研究提示紫草油能促进肛瘘术后创面的愈合及缩短愈合时间，可能通过调节TGF-β1/Smad3信号转导通路中TGF-β1及Smad3 因子表达水平。因此如何根据 TGF-β1/Smad3通路的变化规律，有针对性地进行科学地调控，也是我们进一步研究的难点。

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（收稿日期：2018-07-02 本文編辑：许俊琴）