循环肿瘤细胞参与肿瘤复发转移机制的研究进展

黄名威 吴留成 周帆 覃宇周 陈建思

国家癌症中心2015年数据［1］显示，我国每年新发癌症病例约337万，发病率为250/10万，每年癌症死亡人数约211万，死亡率为156/10万，仅次于心脑血管疾病。众所周知，恶性肿瘤治疗后复发或远处转移是治疗失败的主要原因。目前，临床上发现和诊断恶性肿瘤复发转移主要依靠影像学检查及传统的肿瘤标志物监测，但两者均难以早期发现转移或复发，也难以及时反映疗效。因此，寻找更加灵敏的预测因子对监测肿瘤复发转移具有重大现实意义。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）的发现及研究使肿瘤早期诊断及疗效预测成为研究热点之一，本文就CTCs参与肿瘤复发转移机制的研究进展作一综述。

1 循环肿瘤细胞的定义

CTCs是指因自发或诊疗操作由原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞。1869年，澳大利亚A shworth教授在血液中发现类似原发灶肿瘤细胞的循环细胞，并首次提出CTCs的概念［2］。但由于技术原因，CTCs的研究并未引起足够重视，直至Ce llS ear c h系统的问世才激起研究者对CTCs研究的密切关注。由于CTCs研究在肿瘤早期诊断、治疗效果评估及肿瘤复发监测等方面凸显巨大潜力，已成为当前癌症研究的热点之一。近年关于CTCs分离富集技术、鉴定方法及分子机制的研究不断取得新的突破，已在乳腺癌［3］、前列腺癌［4］、肺癌［5］、结直肠癌［6］、头颈部肿瘤［7］、胃癌［8-10］、胰腺癌［11］、肝癌［12］等证实CTCs的存在。研究发现CTCs与早期转移［13］、疗效反应［14］及临床预后［15］等密切相关，并认为CTCs可作为一种新型的诊断工具，为临床提供良恶性诊断、临床分期判定等信息，辅助临床医师诊断和治疗。检测CTCs较传统的侵入性病理活检具有取材方便、非创伤性、避免肿瘤转移扩散和良好的重复性等特点，因此又被称为“液相活检”［16-17］。

2 CTCs的分离富集

由于外周血中CTCs的数量极少，仅为1～10个/10mL，因此，要从数百万计的血细胞中分离CTCs，对技术的要求极高。根据分选原理不同，CTCs的分离富集技术可分为两大类［18］：一是根据CTCs的物理学特性，如大小、密度、电荷及可塑性等进行分离富集。方法主要有密度梯度离心法、膜过滤法及介电泳分离富集法等，每种富集方法均有其优缺点。密度梯度离心法简单经济，但需要的血量较大，且分离后纯度较低，易受单核细胞影响；而膜过滤法虽简便、易于操作，但小于滤膜孔径的CTCs会丢失，因此灵敏度较低；介电泳分离富集技术虽特异性较强、回收率较高，但因其通量较小、耗时较多，很少应用于临床。二是根据CTCs的生物学特性进行分离富集，即根据CTCs表达的抗原有别于外周血细胞将捕获的抗体包被于磁珠表面，利用抗原抗体特异性结合，当血液经外磁场时抗原抗体复合物被吸附并滞留，从而达到分离富集的目的。基于免疫学原理的CTCs分离富集技术的关键是寻找到理想的细胞标志物，即用于识别的细胞抗原是CTCs特有且恒定表达的抗原，目前这种理想的标志物尚未发现。由于大多数的实体肿瘤来源于上皮细胞，因此上皮细胞表面标志物（如EpCAM、CK等）是目前研究上皮来源恶性肿瘤CTCs最常用的标志物［18］。免疫分离富集法又可分为阳性分选法和阴性分选法。阳性分选法以CTCs作为目的细胞进行直接捕获，Cell Search系统是阳性分选技术的经典代表。近年研究较多、发展最迅速的微流体芯片捕获法［19-21］也属于阳性分选法，该法将包被有E pC A M抗体的芯片附着于硅片上，当全血流经硅片时，芯片对CTCs进行捕获。微流体芯片分离富集方法自动化程度高，富集的CTCs纯度高，但因制作复杂，成本高昂，且受周围血流通畅性的影响，距大范围临床应用尚需时日。依赖上皮细胞表面标志物进行分离富集CTCs的方法面临的主要问题是可能出现假阴性和假阳性结果。研究表明，肿瘤细胞在脱落入血过程中，发生上皮-间质转化（epi t he l ia l me s en c hyma l t ran s i t ion，E MT），肿瘤细胞表面标志物表达发生变化［22］，即上皮来源的标志物表达下降，而间质细胞标志物（如V imen t in、T wi s t等）表达上调，导致无法检测到部分CTCs而产生假阴性结果；另外，血循环中上皮来源的细胞可能并非均为肿瘤细胞，已有报道［23］从结肠良性病变患者外周血中检测到循环上皮细胞的存在。因此，以上皮细胞标记进行CTCs分离富集可能产生假阳性结果。与阳性分选法相反，阴性分选法先去除血细胞，最后达到富集CTCs的目的。阴性分选法不依赖CTCs表面标志物的表达，因此可用于多种肿瘤的CTCs富集，且富集的细胞活性较高，可作进一步培养鉴定。但阴性富集法同样存在缺陷，即纯度不高，容易出现假阳性结果等。

3 CTCs的检测鉴定

根据CTCs特性进行分离富集的过程亦是对CTCs检测的过程，但有时为进一步鉴定还需采用一些针对肿瘤细胞的技术方法对CTCs进行检测。常用的检测技术方法有免疫细胞化学法（immunocy to chemistry，I CC）、荧光原位杂交法（fluorescence in situhy bridiation，FISH）和RT-PCR法等。ICC技术借助针对肿瘤抗原的抗体反映细胞内抗原的表达，在细胞层面进行计数和鉴定。I CC鉴定CTCs的主要缺点是缺乏特异性的肿瘤标志物。FISH技术利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过荧光显微镜下观察荧光信号，计数与特异探针杂交后被染色的细胞。Li等［24］利用SET-iFISH技术对晚期胃癌患者CTCs进行检测，结果阳性率为90.5%，灵敏性较高。RT-PCR法主要检测来自CTCs的肿瘤基因表达，但CTCs经过E MT后，其基因表达会发生变化，因此该法的特异性受限；同时由于PCR技术本身的高敏性，亦可能出现假阳性结果［25］。此外，为研究CTCs的生物学功能（如成瘤性、侵袭性等），需对富集的CTCs进行体外培养或体内移植成瘤等实验［26-27］，但由于CTCs数量极少，其中包含的成瘤性细胞（如肿瘤干细胞或肿瘤起始细胞）更少，因此功能性实验仍面临许多困难。

4 CTCs参与肿瘤复发转移的机制

尽管研究已证实CTCs的存在与肿瘤分期、预后及治疗反应等有关，但对CTCs分子生物学机制的研究仍处于初步探索阶段。研究表明，并非所有的CTCs均具备转移能力。侵入循环系统的肿瘤细胞大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤或失巢凋亡可在短期内死亡，只有极少数存活，在适宜自身存活和增殖的器官或组织形成转移灶。这些少数的CTCs如何获得存活甚至在靶器官定植、增殖形成转移灶的能力及其调控机制仍是目前的研究热点［28］。

4.1 E MT与CTCs

研究发现CTCs在转移过程中会产生不同的表型变化，以逃避机体的免疫杀伤或获得抵抗失巢凋亡的能力，适应新的生存环境，其中最重要的表型变化是E MT［28］。E MT是上皮表型细胞转变为具有间质细胞特性的过程，表现为各类上皮标志物（如E pC A M、C K等）表达减少和间质细胞来源蛋白质（如波形蛋白等）表达增加。利用这一特点，研究者发现许多肿瘤CTCs表现出E MT特性，如转移性前列腺癌CTCs中E MT相关基因高表达［29］；胃癌CTCs不仅存在上皮、间质分型，且间质型CTCs还可能与治疗预后相关［30］；转移性非小细胞肺癌CTCs中波形蛋白高表达［31］；最近我国多家大型医疗中心联合研究结果同样发现结直肠癌中存在E MT现象，通过检测CTCs上皮和间质表型相关基因对CTCs进行分型有助于判断肿瘤分期及预后等［32］。这些研究结果均提示CTCs中存在E MT现象。通过E MT过程，肿瘤病灶细胞间的紧密连接和黏附可发生改变，而具有侵袭转移潜能的CTCs常表现出E MT特性，这可能与E MT可促使单个细胞从紧密连接的细胞层分离并游走迁移至血管有关［33］。E MT对促进CTCs渗透到血管和维持CTCs在血管中生存也有一定作用［34］；E MT还可能促使CTCs获得干细胞特征而更易于复发转移及耐药［35-36］。基于E MT在CTCs中的重要作用，从E MT方向研究CTCs的分子生物学机制十分必要。国内学者基于Canpa t ro l TM技术平台［30，32，37］，对结直肠癌患者术前术后的CTCs进行研究，通过检测结直肠癌CTCs上皮标志物EpCAM、CK8、CK18、CK19及间质标志物V imen t in、T wi s t的表达，并利用这些标志物将CTCs分型（上皮型、间质型和混合型）。结果表明，随着病理分期进展，CTCs总数及间质型CTCs比例均显著升高（P＜0.05），而上皮型CTCs比例则显著降低（P＜0.05），且间质型CTCs与远处转移显著相关（P＜0.05）。上述研究结果提示，CTCs在恶性肿瘤进展过程中存在E MT现象，E MT可能是CTCs获得存活及转移能力的重要机制。

4.2 肿瘤干细胞与CTCs

肿瘤干细胞（cancerste mcells，CSCs）是一类具有自我增殖、分化、更新等特性的肿瘤细胞，已证实在多种肿瘤中存在［38］，并被认为是肿瘤的“种子”细胞。而CTCs作为存在于血液系统中高活力、高转移潜能的细胞，可能具备C S C s特性。研究发现，在黑色素瘤［39］、转移性乳腺癌［40］及肺癌［41］中存在高表达CD133的CTCs，且其与不良预后密切相关。头颈部肿瘤［42］、转移性乳腺癌［43］、胃癌［44］的CTCs则存在CD44+亚群；相较于原发乳腺癌，A LDH1high/TW IS T nu c的CTCs在转移性乳腺癌中更常见［45］。但也有研究发现，在转移性结直肠癌CTCs与CD44或CD133不存在相关性，而A LDH1、S ur v i v in、M R P5与CTCs显著相关［46］。由于CTCs具有E MT的特性，间质型CTCs通常被认为更有形成转移灶的能力。但T am等［47］则提出不同的看法，认为介于上皮型和间质型的CTCs表型才可能具有远处转移形成肿瘤的能力，即具备C S C s的特性。综上所述，CTCs与C S C s虽然具有共同特征，但两者并不完全等同，C S C s可能是CTCs的一种特殊类型，或者是具有干细胞特性的异质性CTCs，这使CTCs可长期存在于血液循环并保持高侵袭转移性。

5 展望

CTCs的存在已得到证实，且与肿瘤复发转移关系密切。CTCs的分离富集和检测技术已取得巨大进步，但对CTCs生物行为及机制仍知之甚少。因此CTCs检测应用于临床诊断及治疗的意义和价值还需进一步研究。当前CTCs的研究大多着眼于CTCs自身特性而忽略CTCs与原发灶、CTCs与肿瘤微环境及机体内环境的整体关系。肿瘤机体内环境的失衡对CTCs生物学行为的调控可能是大多数恶性肿瘤出现复发转移的重要机制。CTCs能在血液循环中存活并最终增殖形成转移灶，这离不开生长因子及相应信号通路的维持与调控，而针对这一领域的研究则有可能成为打开恶性肿瘤复发转移机制之门的一把金钥匙。

［1］ 陈万青，郑荣寿，张思维，等.2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析［J］.中国肿瘤，2016，25（1）：1-8.

［2］Ashworth TR.A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death［J］.Aust Med J，1869，14：146.

［3］wata H，Masuda N，Yamamoto D，et al.Circulating tumor cells as a prognostic marker for efficacy in the randomized phase III JO21095 trial in Japanese patients with HER2-negative metastatic breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2017，162（3）：501-510.

［4］Kuske A，Gorges TM，Tennstedt P，et al.Improved detection of circulatingtumorcellsinnon-metastatichigh-riskprostatecancerpatients［J］.Sci Rep，2016，6：39736.

［5］Gao W，Yuan H，Jing F，et al.Analysis of circulating tumor cells from lung cancer patients with multiple biomarkers using high-performance size-based microfluidic chip［J］.Oncotarget，2017，8（8）：12917-12928.

［6］Zhang D，Zhao L，Zhou P，et al.Circulating tumor microemboli（CTM）and vimentin+circulating tumor cells（CTCs）detected by a size-based platform predict worse prognosis in advanced colorectal cancer patients during chemotherapy［J］.Cancer Cell Int，2017，17：6.［7］Tinhofer I，Hristozova T，Stromberger C，et al.Monitoring of circulating tumor cells and their expression of EGFR/phospho-EGFR during combined radiotherapy regimens in locally advanced squamous cell carcinoma of the head and neck［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2012，83（5）：e685-690.

［8］Li Y，Zhang X，Gong J，et al.Aneuploidy of chromosome 8 in circulating tumor cells correlates with prognosis in patients with advanced gastric cancer［J］.Chin J Cancer Res，2016，28（6）：579-588.

［9］Watanabe T，Okumura T，Hirano K，et al.Circulating tumor cells expressing cancer stem cell marker CD44 as a diagnostic biomarker in patients with gastric cancer［J］.Oncol Lett，2017，13（1）：281-288.

［10］Shimazu K，Fukuda K，Yoshida T，et al.High circulating tumor cell concentrations in a specific subtype of gastric cancer with diffuse bone metastasis at diagnosis［J］.World J Gastroenterol，2016，22（26）：6083-6088.

［11］Poruk KE，Blackford AL，Weiss MJ，et al.Circulating tumor cells expressing markers of tumor-initiating cells predict poor survival and cancer recurrence in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma［J］.Clin Cancer Res，2017，23（11）：2681-2690.

［12］Kelley RK，Magbanua MJ，Butler TM，et al.Circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma：a pilot study of detection，enumeration，and next-generation sequencing in cases and controls［J］.BMC Cancer，2015，15：206.

［13］Rhim AD，Mirek ET，Aiello NM，et al.EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation［J］.Cell，2012，148（1-2）：349-361.

［14］Lee SJ，Lee J，Kim ST，et al.Circulating tumor cells are predictive of poor response to chemotherapy in metastatic gastric cancer［J］.Int J Biol Markers，2015，30（4）：e382-386.

［15］Cristofanilli M，Budd GT，Ellis MJ，et al.Circulating tumor cells，disease progression，and survival in metastatic breast cancer［J］.N Engl J Med，2004，351（8）：781-791.

［16］Tsujiura M，Ichikawa D，Konishi H，et al.Liquid biopsy of gastric cancer patients：circulating tumor cells and cell-free nucleic acids［J］.World J Gastroenterol，2014，20（12）：3265-3286.

［17］Alix-Panabières C，Pierga JY.Circulating tumor cells：liquid biopsy［J］.Bull Cancer，2014，101（1）：17-23.

［18］Alix-Panabieres C，Pantel K.Challenges in circulating tumour cell research［J］.Nat Rev Cancer，2014，14（9）：623-631.

［19］Nagata T，Ohnaga T，Lu XL，et al.Identification of circulating tumor cell（CTC）in breast cancer patients using a newly established CTC detectingsystem［J］.Gan ToKagaku Ryoho，2015，42（10）：1240-1242.

［20］Zhang Y，Zhang X，Zhang J，et al.Microfluidic chip for isolation of viable circulating tumor cells of hepatocellular carcinoma for their culture and drug sensitivity assay［J］.Cancer Biol Ther，2016，17（11）：1177-1187.

［21］Park MH，Reategui E，Li W，et al.Enhanced isolation and release of circulating tumor cells using nanoparticle binding and ligand exchange in a microfluidic chip［J］.J Am Chem Soc，2017，139（7）：2741-2749.

［22］Mikolajczyk SD，Millar LS，Tsinberg P，et al.Detection of EpCAM-negative and cytokeratin-negative circulating tumor cells in peripheral blood［J］.J Oncol，2011，2011：252361.

［23］Pantel K，Deneve E，Nocca D，et al.Circulating epithelial cells in patients with benign colon diseases［J］.Clin Chem，2012，58（5）：936-940.

［24］Li Y，Zhang X，Ge S，et al.Clinical significance of phenotyping and karyotyping of circulating tumor cells in patients with advanced gastric cancer［J］.Oncotarget，2014，5（16）：6594-6602.

［25］Zippelius A，Kufer P，Honold G，et al.Limitations of reverse-transcriptase polymerase chain reaction analyses for detection of micrometastatic epithelial cancer cells in bone marrow［J］.J Clin Oncol，1997，15（7）：2701-2708.

［26］Ramirez JM，Fehm T，Orsini M，et al.Prognostic relevance of viable circulating tumor cells detected by EPISPOT in metastatic breast cancer patients［J］.Clin Chem，2014，60（1）：214-221.

［27］Baccelli I，Schneeweiss A，Riethdorf S，et al.Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay［J］.Nat Biotechnol，2013，31（6）：539-544.

［28］Plaks V，Koopman CD，Werb Z.Cancer.Circulating tumor cells［J］.Science，2013，341（6151）：1186-1188.

［29］Chen CL，Mahalingam D，Osmulski P，et al.Single-cell analysis of circulating tumor cells identifies cumulative expression patterns of EMT-related genes in metastatic prostate cancer［J］.Prostate，2013，73（8）：813-826.

［30］ Li TT，Liu H，Li FP，et al.Evaluation of epithelial-mesenchymal transitioned circulating tumor cells in patients with resectable gastric cancer：relevance to therapy response［J］.World J Gastroenterol，2015，21（47）：13259-13267.

［31］ Lecharpentier A，Vielh P，Perez-Moreno P，et al.Detection of circulating tumour cells with a hybrid（epithelial/mesenchymal）phenotype in patients with metastatic non-small cell lung cancer［J］.Br J Cancer，2011，105（9）：1338-1341.

［32］ Zhao R，Cai Z，Li S，et al.Expression and clinical relevance of epithelial and mesenchymal markers in circulating tumor cells from colorectal cancer［J］.Oncotarget，2017，8（6）：9293-9302.

［33］ Lim SH，Becker TM，Chua W，et al.Circulating tumour cells and the epithelial mesenchymal transition in colorectal cancer［J］.J Clin Pathol，2014，67（10）：848-853.

［34］ Liu H，Zhang X，Li J，et al.The biological and clinical importance of epithelial-mesenchymal transition in circulating tumor cells［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2015，141（2）：189-201.

［35］ Mani SA，Guo W，Liao MJ，et al.The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells［J］.Cell，2008，133（4）：704-715.

［36］ Li H，Batth IS，Qu X，et al.IGF-IR signaling in epithelial to mesenchymal transition and targeting IGF-IR therapy：overview and new insights［J］.Mol Cancer，2017，16（1）：6.

［37］ Wu S，Liu S，Liu Z，et al.Classification of circulating tumor cells by epithelial-mesenchymal transition markers［J］.PLoS One，2015，10（4）：e0123976.

［38］ 陆云飞，黄名威.肿瘤干细胞的起源与肿瘤的防治策略［J］.肿瘤防治研究，2011，38（7）：838-839，843.

［39］ Fusi A，Reichelt U，Busse A，et al.Expression of the stem cell markers nestin and CD133 on circulating melanoma cells［J］.J Invest Dermatol，2011，131（2）：487-494.

［40］ Armstrong AJ，Marengo MS，Oltean S，et al.Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers［J］.Mol Cancer Res，2011，9（8）：997-1007.

［41］ Skirecki T，Hoser G，Kawiak J，et al.Flow cytometric analysis of CD133-and EpCAM-positive cells in the peripheral blood of patients with lung cancer［J］.Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2014，62（1）：67-75.

［42］ Balasubramanian P，Lang JC，Jatana KR，et al.Multiparameter analysis，including EMT markers，on negatively enriched blood samples from patients with squamous cell carcinoma of the head and neck［J］.PLoS One，2012，7（7）：e42048.

［43］ Theodoropoulos PA，Polioudaki H，Agelaki S，et al.Circulating tumor cells with a putative stem cell phenotype in peripheral blood of patients with breast cancer［J］.Cancer Lett，2010，288（1）：99-106.

［44］ Li M，Zhang B，Zhang Z，et al.Stem cell-like circulating tumor cells indicate poor prognosis in gastric cancer［J］.Biomed Res Int，2014，2014：981261.

［45］ Papadaki MA，Kallergi G，Zafeiriou Z，et al.Co-expression of putative stemness and epithelial-to-mesenchymal transition markers on single circulating tumour cells from patients with early and metastatic breast cancer［J］.BMC Cancer，2014，14：651.

［46］ Gazzaniga P，Gradilone A，Petracca A，et al.Molecular markers in circulating tumour cells from metastatic colorectal cancer patients［J］.J Cell Mol Med，2010，14（8）：2073-2077.

［47］ Tam WL，Weinberg RA.The epigenetics of epithelial-mesenchymal plasticity in cancer［J］.Nat Med，2013，19（11）：1438-1449.