儿童结核病的诊断新进展

夏露　张峣　卢水华

结核病是当前导致发展中国家儿童死亡的主要疾病之一，2016年世界卫生组织(WHO)报道全球新发儿童结核病患者100万例，死亡14万例[1]。英国谢菲尔德大学研究组在《柳叶刀·全球卫生》上的研究表明，利用新的计算模型来估算2015年全球儿童因结核病死亡的人数，5岁以下的儿童死于结核病的例数大约为20万例[2]，这个数据说明WHO关于儿童结核病的数据有可能被低估。

中国的儿童结核病疫情同样不容乐观，2016年WHO报道中国儿童结核病患者发病例数为7.5万例(其中女3.7万例，男3.8万例)[1]。全国第四次结核病流行病学抽样调查结果显示，0～14岁儿童结核病感染率为9%，活动性肺结核患病率为91.8/10万，估算约有2608万例儿童感染结核分枝杆菌，活动性肺结核患儿约26.6万例。其中，儿童菌阳肺结核的患病率为12.3/10万，儿童涂阳肺结核的患病率为6.7/10万[3]。

庞大的患病率必然使儿童结核病成为WHO关注的焦点，2014年WHO出版了《国家结核病规划关于儿童结核病处理指南》[4]，并从战略上提出了《全球儿童结核病零死亡率蓝图》[5]，可以展望儿童结核病的防控未来将获得长足进步。但是由于儿童具有咳嗽反射较弱、细菌载量较低、痰标本获取较为困难、痰涂片阳性率较低，以及肺外结核所占比例较高等特点，儿童结核病的诊断目前仍面临着巨大的挑战，零死亡率短期内尚不可能实现。降低死亡率的重点是要提高儿童结核病的早期诊断率，实验室检查是结核病诊断、治疗及预防控制的重要依据。近年来出现了一些新的诊断方法用于诊断儿童结核病，譬如γ干扰素释放试验(IGRA)、分子诊断技术、早期分泌靶抗原-6(ESAT-6)和培养滤液蛋白-10(CFP-10)融合蛋白皮肤试验等，大大提高了儿童结核病的确诊率，笔者对以上诊断方法在儿童结核病中的最新进展进行综述。

一、IGRA

目前，结核分枝杆菌特异性的IGRA已被WHO列入结核病的诊断指南, 并且已推荐用于帮助诊断儿童的潜伏结核感染和结核病[6]。它主要是用两种结核特异性蛋白——ESAT-6及CFP-10，来刺激外周血中结核特异性T淋巴细胞释放γ干扰素(IFN-γ)，从而进行检测。根据检测方法的不同，IGRA主要有两种技术：一种是酶联免疫吸附试验(ELISA)，另外一种是结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)。研究显示，这两种方法对结核感染的诊断价值相当[7]。Shimizu等[8]入组了52例15岁以下的潜伏结核感染或活动性结核病患者，所有患者均行T-SPOT.TB与结核菌素皮肤试验(TST)，结果发现T-SPOT.TB检测为阳性的患者有9例(17.3%)，TST试验结果为阳性的患者有12例(23.1%)，有7例患者出现T-SPOT.TB与TST试验结果不一致的情况，这7例患者结合影像学检查资料及与结核病患者接触史，均提示有潜伏结核感染或活动性结核病；可见，单用T-SPOT.TB或TST可能会误诊，建议联合应用T-SPOT.TB与TST检查提高诊断率。孙琳等[9]关于T-SPOT.TB在不同年龄活动性结核病患儿诊断中的应用价值的一项研究发现，在1072例研究对象中，T-SPOT.TB的敏感度与TST试验相近，特异度高于TST试验，该研究证明了T-SPOT.TB在各年龄阶段的儿童均具有较好的敏感度和特异度，在活动性结核病患儿的辅助诊断中具有一定的应用价值。

Bielecka等[10]的研究分析了ELISA检测中IFN-γ在不同年龄儿童中、不同采血管中释放水平的差别。该研究共入组153例疑似结核病患儿，其中，45例儿童年龄≤5岁，108例儿童年龄>5岁；在阳性对照管中，IFN-γ水平与年龄呈正相关，在结核抗原管中呈负相关，也就是说患者年龄越小，IFN-γ水平越高。该研究显示ELISA在≤5岁的活动性结核病及潜伏结核感染的患儿中有良好的应用价值，并且其与TST的一致性达到82.52%。Lombardi等[11]的研究进一步验证了年龄越小，ELISA检测出来的IFN-γ水平越高；此外，该研究还进一步说明，IFN-γ在活动性结核病患者中的水平高于潜伏结核感染患者。Sollai等[12]对IGRA在儿童中的应用价值进行了Meta分析，该文章一共包括31项ELISA研究(6183例儿童)，14项T-SPOT.TB研究(2518例儿童)，34项TST研究(6439例儿童)。结果发现，在高收入国家，IGRA检测的敏感度和特异度均高于TST试验；而在低收入国家，IGRA的优势并不明显。

总体来说，IGRA不受机体免疫力及卡介苗(BCG)接种的影响，对潜伏期、不典型结核、肺外结核，以及HIV并发结核感染具有较高的诊断价值，但是否为活动性结核病，IGRA需要结合临床症状及其他检测指标进行综合判断，以便准确区分活动性结核病和潜伏期结核感染。

二、GeneXpert MTB/RIF检测

本系统是一种半定量巢式实时聚合酶链式反应(PCR)体外诊断试验，实时PCR技术和反转录PCR技术相结合，可以同时检测结核分枝杆菌和其对利福平的耐药性，2 h可以获得检测结果[13]。WHO建议GeneXpert MTB/RIF(以下简称“Xpert”)可取代痰涂片和痰培养检测，作为检测疑似肺结核、疑似耐多药肺结核或并发HIV感染的首选方法[4]。目前，各国关于Xpert在儿童结核病不同诊断金标准、不同样本种类、数量及保存条件、不同并发症患儿中的应用都有大量报道。

当选取不同金标准时，Xpert敏感度、特异度不同。以结核分枝杆菌培养为金标准时，美国Detjen等[14]对Xpert检测在儿童肺结核的应用进行了Meta分析，总共纳入15项研究，包括3640例儿童肺结核患者，4768个呼吸样本；研究结果发现，痰液Xpert检测的敏感度和特异度分别为62%和98%，胃液Xpert检测的敏感度和特异度分别为66%和98%。以综合临床参考标准(composite clinical reference standard，CCRS)为金标准时，Nhu等[15]的研究发现，Xpert检测在肺结核患儿中的敏感度可达50.0%，明显高于痰培养及痰涂片；Xpert检测的阳性率较结核分枝杆菌培养高33.9%，较抗酸染色镜检高48.7%以上。中国的一项研究发现，支气管肺泡灌洗液的结核分枝杆菌涂片、培养和Xpert检测的敏感度分别为8.4%、28.9%和53%，3种检测方法的特异度均为100.0%[16]，该研究证明Xpert检测的诊断敏感度远远高于培养。南非的一项研究纳入了102例疑似骨关节结核患者，其以病理结果为金标准，发现Xpert检测的敏感度和特异度分别为73.9%、100.0%[17]。

不同样本种类、数量及储存方法对Xpert的检测结果影响较大。南非Bunyasi等[18]发现，采集患者 1 份胃液进行Xpert检测的敏感度、特异度分别为9.4%、99.9%，2份胃液进行检测的敏感度、特异度分别为22.6%、99.4%；采集患者1份诱导痰进行检测的敏感度、特异度分别为22.6%、100%，2份诱导痰进行检测的敏感度、特异度分别为26.7%、100%。印度Singh等[19]的研究纳入130例肺结核患儿，每例患者均连续2 d 收集诱导痰及胃液行检查，也发现连续 2 d 收集样本可明显增加培养及Xpert检测的阳性率。此外，该研究将所有标本储存于-80 ℃环境中，发现在保存650～849 d的涂片阳性标本中，诱导痰和胃液进行Xpert检测的敏感度分别为85.7%和77.1%；如果保存超过1050 d，敏感度则分别下降到33.3%和50.0%。Banada等[20]进行了粪便Xpert检测诊断肺结核的研究，该研究入组了痰液或胃液Xpert检测阳性的20例确诊肺结核的儿童及20例非结核病儿童，分别取患儿0.2 g、0.6 g和1.2 g粪便进行Xpert检测，发现用0.6 g粪便进行Xpert检测时，敏感度、特异度最高，分别为85%、100%。

患者的并发症、营养状况也可能影响Xpert检测的结果。Chisti等[21]报道了在严重营养不良和重症肺部感染儿童中，采用诱导痰和胃液进行Xpert检测的诊断率均较培养高。

以上关于Xpert检测的报道中，多数报道Xpert检测的敏感度低于痰培养检查[14,18-20]，少量研究提示Xpert检测的敏感度高于结核分枝杆菌培养，考虑可能与Xpert检测阴性的患者随访缺失，造成敏感度假性升高有关。总体来说，Xpert检测在儿童肺结核及耐药结核病的诊断效能较高，联合培养可提高儿童结核病的确诊率，且操作简便，检出时间快，是目前较为理想的儿童结核病诊断方法。

目前，最新一代Xpert MTB/RIF Ultra检测(简称Xpert Ultra)已问世，传统Xpert检测的最小检出菌量为131 CFU/ml，BACTEC MGIT培养的最小检出菌量为10～100 CFU/ml[14]，而Xpert Ultra检测最小检出菌量仅为10 CFU/ml。一项大型前瞻性多中心研究显示，Xpert Ultra的敏感度高于Xpert，但两者在检测是否对利福平耐药时差异无统计学意义[22]。Xpert Ultra用于儿童结核病的检测效能目前尚未见文章报道，相信未来2年应该有儿童结核病应用Xpert Ultra检测的研究出现。

其他的分子生物学技术还包括环介导等温扩增技术(LAMP)、RNA恒温扩增实时荧光检测技术(SAT)、线性探针技术(LPA)等，但其应用于儿童的数据极少，暂且不进行详细阐述。

三、重组ESAT-6和CFP-10融合蛋白皮试试验

TST是诊断结核病的一种传统方法，其操作简便易行，成本低廉。但TST缺少预期的特异度及敏感度，由于BCG接种较为普及，非结核分枝杆菌感染率也较高，使TST出现了较高的假阳性率，诊断特异度较低。CFP-10与ESAT-6仅存在于结核分枝杆菌复合群和少数致病性结核分枝杆菌基因组中，所有BCG菌株及绝大部分环境分枝杆菌(海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌除外)基因组均无该区基因。因此，目前由重组ESAT-6和CFP-10融合蛋白制成的结核诊断试剂已成为热点，如丹麦国立血清研究所的C-Tb皮试试验、俄罗斯的“diaskintest (DST)”皮肤试验、中国的ESAT6-CFP10(EC)皮试试验，均是研究较系统、规模较大的团队。2017年丹麦Morten Ruhwald 研究团队[23]关于C-Tb皮试的研究发表在《柳叶刀-呼吸医学杂志》上，该试验在2012—2014年期间共入组了979例受试者(其中5岁以下受试者共35例，5～17岁受试者共86例)，所有受试者均行TST、ELISA、C-Tb检测。结果发现，随着结核感染风险增加，C-Tb的阳性率也逐步增高，在活动性结核患者里面，C-Tb阳性率稍低于ELISA，C-Tb与TST检测安全性相当。Slogotskaya等[24]的研究共纳入2609例成年及未成年的肺结核、肺外结核、潜伏结核感染、非结核病、接种BCG的受试者，所有受试者均行DST试验及TST试验。该研究结论说明DST试验在所有类型儿童及青少年受试者中，都具有很高的敏感度和特异度。在中国开展的重组结核分枝杆菌EC变态反应原人体临床试验Ⅰ、Ⅱa期已完成，EC皮试后24～72 h诊断的敏感度为85.88%，特异度为92.86%，与皮试前T-SPOT.TB检查的诊断一致率达90.07%。同时证实，重组蛋白EC在健康人群和肺结核患者中检测的安全性良好，皮试后无潜在增敏风险，诊断敏感度和特异度与T-SPOT.TB相当，而明显优于TST[25-26]。目前，中国EC Ⅲ期在儿童结核病中的临床试验目前已完成，相关数据暂未公布。

总之，ESAT-6和CFP-10融合蛋白皮试试剂无BCG的交叉反应，价格便宜，容易操作，以后在儿童结核病诊断中的应用前景较乐观。

四、临床症状诊断

WHO推荐基于症状的筛查方法可以提高儿童结核病的诊断率[27]。Mulenga等[28]的研究一共入组了1017例疑似肺结核的患儿，持续咳嗽在临床诊断肺结核的患儿中阳性率为16.9%(172/1017)，结核分枝杆菌培养及Xpert检测的总阳性率为3.7%(38/1017)，X线胸部摄影检查的阳性率为12.9%(131/1017)，咳嗽的OR值是培养及Xpert检测阳性率的3倍，并且持续咳嗽是唯一在重症肺结核及非重症肺结核中有差别的症状。Triasih等[29]的研究显示，在98例有体质量减轻和咳嗽、发热等症状的儿童里面，有21%的儿童患者最后被诊断为肺结核；171例无结核感染相关症状的患者，最终0例确诊为活动性结核病。该研究表明，基于症状诊断结核病是一种简单而安全的筛查方法，可以在初级保健水平上实施。总体来说，有以下3条症状的儿童应高度怀疑活动性结核病[30]：(1)持续咳嗽2周以上；(2)近3个月内发育迟缓；(3)乏力。

此外，相应器官的影像学检查、血红细胞沉降率、结核抗体、组织活检等均有利于儿童结核病的诊断，因以上检查特异度不高，需结合病原学、分子生物学检查联合判断，且近几年在儿童结核病的诊断方面无较多进展，在此不一一详述。

综上所述，我国目前儿童结核病流行的趋势还相当严峻。在诊断儿童结核病时，由于取得细菌学诊断依据较难，现有实验室或影像学检查都不能达到令人满意的诊断敏感度，故我们应采取多样本、多个诊断测试的组合以获得更好的诊断收益。随着新技术的不断涌现，多种有潜力的新诊断方法被开发并逐步在临床应用，例如现代分子生物学方法是目前较好的诊断技术，可快速地为病原学诊断提供重要的线索。但无论哪种方法均各有优劣，对儿童结核病还需结合临床表现及多种联合诊断方法的检测结果加以综合诊断。

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