黄连解毒汤治疗阿尔茨海默病作用机制研究进展

顾欣如王宏洁杨健司南赵海誉方思月边宝林

1.中国中医科学院中药研究所 北京 100700 2.北京中医药大学

世界范围内，阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）已成为引发老年人死亡的第四大病因。我国 AD患病人数以990万位居世界第一，65岁以上老人发病率约为6.5%，严重影响老年人生活质量，高额医疗费用给家人及社会带来沉重经济负担。以β淀粉样蛋白（Aβ）为靶标的单克隆抗体药物在III期临床屡遭失败[1]。随着近年对AD发病机制的研究，脑内中枢神经系统慢性炎症及脂质代谢异常成为其重要的病理特征。王永炎院士在多年临床实践基础上提出“毒损脑络”的崭新理论[2]，该理论的提出大大推动了中医脑病学的发展，也为中医对AD病机的认识以及治疗提供了新思路。黄连解毒汤为清热解毒代表方剂，始载于《肘后备急方》[3]。方中以黄连为君，泻中焦之火，清心经之热；黄芩为臣，泻上焦之火，清肺热；黄柏为佐，泻下焦之火，清肾经虚热；栀子为使，通泻三焦之火，导火下行。四药合用，苦寒直折，使火邪去而热毒解，诸症可愈。现代药理研究表明，黄连解毒汤具有抗炎、抗氧化、调节肠道菌群、改善胆固醇代谢等活性，临床对肿瘤、脑缺血、肝损伤、II型糖尿病和老年性痴呆等疾病具有良好作用[4-10]。基于黄连解毒汤的多靶点作用机制以及AD的发病机制不清、病理特征多样的特点，本文在参考大量文献的基础上，分类整理，围绕炎症、氧化应激、脂代谢异常及菌群失调等方面，总结黄连解毒汤在AD药理研究进展，同时为清热解毒方药在治疗AD研究中提供思路。

1 改善阿尔茨海默病患者痴呆症状

在临床应用中，黄连解毒汤连续使用3个月后可明显改善AD患者智力和生活能力，并且红细胞超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性及血浆脂质过氧化物（lipid peroxide,LPO）含量指标也较治疗前有显著差异性（P＜0.01）[11]。令人振奋的是，在与脑复康片（酰胺吡酮）、都可喜（吡拉西坦）等进行的临床随机对照试验中，黄连解毒汤显示了与化学药物疗效相当的治疗效果[12]。王帆等[13]总结了近年来有关黄连解毒汤相关的研究资料，进一步明确了AD辨证施治中黄连解毒汤的重要地位并提供了现代理论支持。黄连解毒汤能明显改善AD的临床症状，总有效率77.27%，石杉碱甲对照组总有效率达58.33%，经统计学分析，治疗组疗效优于对照组（P＜0.05）。徐雷[14]报道黄连解毒汤能够有效改善AD患者的临床症状，提高其日常生活能力，其机制可能与黄连解毒汤能有效清除脑内β-淀粉样蛋白，降低脑内细胞炎性因子有关。AD日益成为危及老年人健康、影响老年人生活质量的主要不利因素。基于中药在慢性病治疗上的优势，黄连解毒汤抗AD活性物质基础的深入研究对于解决我国AD患者痛苦，减轻医疗费用负担具有深远的意义。

2 治疗阿尔茨海默病的作用机制

2.1 缓解中枢慢性炎症反应 中医学认为“毒损脑络”是AD的重要病机之一，外邪化热成毒，损伤脑络，从而导致脑窍壅塞，神机失灵而发为痴呆[15]。现代医学认为，AD是一种神经系统退行性病变，β淀粉样蛋白沉积形成的老年斑，tau蛋白过度磷酸化导致的神经纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生是AD发作的主要病理特征。Aβ异常分泌，在脑组织内沉积，对周围的突触和神经元具有毒性作用，破坏突触后膜，最终引起神经细胞死亡。近年来以Aβ为靶标的单克隆抗体药物在Ⅲ期临床屡遭失败，西药治疗出现瓶颈。2000年，神经免疫炎症概念正式提出，炎症反应被认为是 Aβ沉积所引起的局部继发性反应，同时又是中枢神经系统（central nervous system,CNS）退行性变的重要因素。小胶质细胞（microglia）是定居在脑内的吞噬细胞，是 CNS中的第一道也是最主要的一道免疫防线，能清除中枢神经系统中损坏的神经、斑块及感染性物质。然而过量的 Aβ堆积能够刺激小胶质细胞释放炎症因子；白介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、NO 等神经毒性物质[16-17]，而这些细胞因子又会刺激小胶质细胞释放活性氧，促进其分裂增殖。黄连解毒汤具有苦寒之性，是清热解毒的经典方，可有效地缓解内毒蕴积、热伤脑络之证。黄连解毒汤一直以来即用于治疗急性传染性疾病和感染性疾病,现代药理学研究表明其具有良好的抗菌、消炎、提高免疫功能的作用。黄连解毒汤能明显降低毛细管通透性，对二甲苯诱发的小鼠耳廓水肿有显著影响，表明黄连解毒汤具有抗炎镇痛的作用[18]。还可以降低高脂血症小鼠血清中内毒素、TNF-α和IL-6的水平，其抗炎作用类似抗生素[19]。任维等[20]采用 UPLC-QQQ-MS检测方法，分析了生物碱、黄酮及环烯醚萜三大类成分的体内消长变化，证实了药物在“实热火毒”证动物体内的作用与正常状态不同，同时发现黄连解毒汤能下调与炎症相关的促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 和 MIP-2）的含量，药代和药效结合分析，初步阐释了黄连解毒汤抗炎的药效物质基础及可能的作用机理。流行病学发现许多能量代谢异常均与AD有关，而调节能量代谢的腺苷酸激活蛋白激酶（activated protein kinase,AMPK）在AD发病过程中起重要作用[21]。在体外实验中发现，黄连解毒汤可以增强AMPK的活性，抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的巨噬细胞中核因子-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）信号通路和大鼠嗜碱性白细胞中Lyn激酶介导的信号通路，从而改善细胞内炎症和过敏反应[22]。

2.2 改善阿尔茨海默病氧化应激状态 脑组织约占人体总重的2%～3%，而其耗氧量却是人体总耗氧量的20%。在人体衰老的自然过程以及脑缺血状态下,机体内会有大量自由基，从而导致体内氧化和抗氧化系统失衡，SOD、过氧化氢酶（catalase,CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化的活性降低，产生大量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）、活性氮（reactive nitrogen species,RNS）等自由基[23]，一氧化氮（nitric oxide，NO）与超氧阴离子反应生成活性更强的过氧亚硝基（peroxynitrite anion，ONOO-）及·OH，破坏细胞膜的完整性，损伤线粒体、脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核苷酸（ribonucleic acid，RNA）。强有力的证据表明 ROS和 RNS的增加引起的氧化应激和许多抗氧化防御酶功能丧失和AD有着重要关系。Aβ的神经毒性诱导氧化应激产生过量的 ROS,刺激生物膜上的多元不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，再通过非酶解作用产生强毒性的氧化应激标志（4-hydroxy-2,3-nonenal，4-HNE），AD 患者的神经营养因子（neurotrophic factor，NTF）中存在着大量的 4-HNE促进tau蛋白神经纤维缠接的形成[22]。关于黄连解毒汤的抗氧化作用早有报告，临床上常用于治疗心脑血管疾病。血清药理学研究表明，黄连解毒汤对 H2O2所致PC12细胞氧化应激损伤具有保护作用，并呈剂量依赖性[25]。而小檗碱可以灭活 O2、OH·、NO及OONO－等高活性分子，具有直接清除ROS的能力[24]。在脑中风模型大鼠体内，发现黄连解毒汤能够显著减少梗死面积，恢复 NO、丙二醛（malonaldehyde,MDA）、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、三肽(glutathione,r-glutamyl cysteingl+glycine,GSSG)、T-SOD、Cu/zn-SOD、MN-SOD 和GSH-PX等生化指标的水平，提高自噬相关基因Beclin1和微管相关蛋白轻链3的表达，促进胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、蛋白激酶（protein kinase，Akt）和 3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶（phosphoinositide-dependent kinase 1,PDK1）等活性，抑制雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）、P38、同源性磷酶-张力蛋白等的活性[25]。杨新报告黄连解毒汤还可以通过调节胰岛素抵抗大鼠体内MDA、SOD和GSH-PX的水平，增加对胰岛素的敏感性，提高抗氧化应激能力并改善内质网应激状态[28]。邱昕等[29]发现高、中剂量的黄连解毒汤抗自由基氧化，保护神经细胞，减少老年斑沉积的效果大于安理申。在临床应用中，黄连解毒汤连续使用3个月后明显改善AD患者智力和生活能力，并且红细胞SOD活性及血浆脂过氧化物（lactoperoxidase,LPO）含量指标较之前有显著差异性（P＜0.01）[11]。

2.3 改善阿尔茨海默病脂代谢异常 多元不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）是人体内重要的生理活性物质，主要包括ω-3和ω-6多元不饱和脂肪酸。PUFAs具有限制中性粒细胞过度活化和募集、促进巨噬细胞吞噬等功能,通过对细胞浸润、炎症因子的分泌、细胞凋亡等多环节调控，加快抗炎促炎消退效应。其结构类型主要有来源于花生四烯酸（ω-6，Arachidonic acid,AA） 衍生的脂氧素（lipoxin,LX）系列、来源于二十碳五烯酸（ω-3，Eicosapentaenoic acid,EPA）的E系列（E series,RvE）、来源于二十碳六烯酸（ω-3，Docosahexaenoic acid,DHA）的 D系列（D series,RvD）。AD病程早期，小胶质细胞过度激活，产生大量自由基和炎性因子，慢性神经免疫炎症随即产生，连带神经元损害，突触丢失。组织学检查显示，AD患者海马及脑脊液中促炎消退介质（specialized pro-resolving mediator,SPMs）、脂氧素 A4（lipoxins,LXA4）和消退素 D1（resolvin,RvD1）水平显著下降，其对应的脂氧素代谢酶和特异性促消退介质(specialized pro—resolving mediators,SPMs)受体表达升高，且LXA4和RvD1脑脊液水平与其生前简易能量表（mini-mental state examination,MMSE）测试成正相关[30-31]。海马及脑脊液中SPMs，生物合成酶及下游抗炎，促炎因子成为此过程中重要的调控元件，具脑内炎症稳态平衡生理意义[32]。AA是人体必需游离脂肪酸之一。在环氧合酶（cyclo-oxygenase,COX）和脂氧合酶（lipoxygenase,LOX）的作用下生成前列腺素类（prostaglandins,PGS）、血栓素类（thromboxanes，TXs）、白三烯类（leulotrienes，LTs）、LXs和 12-过氧化氢羟基花生四烯酸类（12-hydroxy-eicosatetraenoic acid,12-HPETE）物质，参与人体炎症反应和免疫系统的调控。黄连解毒汤作为清热解毒的代表方，可以显著抑制COX-2和LOX-5的活性、减少NO合成、阻断炎症通路、降低炎性细胞因子含量、缓解小胶质细胞活化[33]，并且可以抑制脑内tau蛋白磷酸化关键蛋白激酶(protein kinases,GSK-3β)及周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK-5)活性，降低tau蛋白磷酸化水平[34-35]。临床研究表明，AD患者总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）及高密度脂蛋白（high density lipoprotein,HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）水平与正常人相比有显著差异。流行性病学及回顾性调查显示，他汀类药物可显著降低AD发病率[36]，提示胆固醇合成紊乱影响AD进程，早期降血脂药物干预对于AD发展至关重要[37]。脑内的胆固醇以24S-羟胆固醇（24S-hydroxycholesterol,HC）的形式透过血脑屏障，在LDL的转运下移至肝脏代谢，催化24S-HC生成的24S-HC酶主要存于在脑内。脑脊液中可以测到的27-HC基本来自血浆，并依赖于血脑屏障的功能。故外周循环或脑脊液中的24S-HC水平高低能很好地反映脑内胆固醇的动态平衡。细胞研究提示，27-HC干预能提高β-分泌酶活性，增加淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein,APP)表达和Aβ-42水平，而24-HC则是通过非淀粉样蛋白途径增加可溶性淀粉样前体蛋白（secretory amyloidprecursorprotein,sAPP）的水平[38]。黄连解毒汤中黄连、黄芩、黄柏为清热燥湿药，栀子为清热泻火药，可直接针对胆固醇堆积引起的“痰、湿、瘀”等症发挥疗效。实验证明，服用黄连解毒汤后，血中胆固醇和甘油三酯水平明显降低，脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase,LPL）活性迅速增高，其作用机制涵盖活化腺苷脱氨酶 (adenosine monophosphate,AMP)、抑制胆固醇酰基转移酶 (cholesterol acyltransferase,ACAT)的活性、抑制胰蛋白脂酶的活性等方面[39]。

2.4 调节肠道菌群实现阿尔茨海默病的潜在治疗作用 人的胃肠道中定植着1000多种细菌，总量约占1～2kg，编码基因是人类基因组的150倍，被称为人类的“第二基因组”。肠道菌群中厌氧菌约占90%，其中厚壁菌门、拟杆菌门占98%。其次为变形菌门、梭杆菌门和疣微菌门。每个人体内菌群的构成都是独一无二的，正常状态下，人体内菌群的种类、数量和比例相对稳定，并与宿主外部环境保持着动态平衡，但随着人体机能正常衰弱和病理状态下，肠道菌群会出现失调现象[40,41]。初生婴儿的肠道菌群构成结构较为简单，主要以双歧杆菌为主，随着饮食结构的改变，其肠道菌群多样性慢慢增加，最终趋于稳定，接近成年人肠道菌群组成[42,43]。而老年人体内肠道菌群的多样性和组成比例较成年人出现了显著性的差异，主要以拟杆菌门和梭杆菌门为主[40]。 Cagnin.A等人利用[C11]R-PK11195和 [C11]DAA1106对AD患者大脑进行正电子发射计算机断层显像（position emission tomography,PET）扫描，发现小胶质细胞、脑内炎症和认知功功能的衰退三者之间有较强的相关性[44,45]。Myles R.Minter等人[46]发现长期以抗生素（ABX）饲养APPSWE/PS1ΔE9双转基因AD模型小鼠而引起的肠道菌群多样性的改变，可以影响细胞因子/趋化因子的比值，降低β-淀粉样蛋白的沉积，减少老年斑附近的胶质增生和小胶质形态学，并以此调节脑内的炎症反应。硝基还原酶是一种能够降解含N化合物的细菌酶，在肠道内主要是由拟杆菌、大肠杆菌和双歧杆菌等分泌。高脂饲料饲养的仓鼠肠道内硝基还原酶的活性增加，小檗碱在高脂饲养的仓鼠体内的生物利用度显著高于正常组，并具有较好的降脂作用。Yang Wang等人[47]在临床研究中发现，高脂血症患者体内硝基还原酶的活性远远大于健康人（P＜0.01），口服小檗碱后，患者体内的血药浓度显著高于正常人（P＜0.05）,因此硝基还原酶的活性可能是小檗碱治疗高脂血症的重要生物标志物。在肝细胞中胆固醇在7α-羟化酶（hydroxylase,CYP7A1）的作用下生成具有24碳的初级胆汁酸，初级胆汁酸进入肠道协助脂质的消化，然后在肠道菌群的作用下水解生成游离的胆汁酸，再经过7位脱羟基的作用生成次级胆汁酸。大部分的胆汁酸在回肠末端重吸收参与肝肠循环，少数的次级胆汁酸（石胆酸和脱氧胆酸）不被吸收从粪便中排除。脱氧胆酸（deoxycholicacid,DCA）可以扰乱脂质双分子层，熊脱氧胆酸（ursodeoxycholic acid,UDCA）可以增加双分子层的稳定性，使线粒体免受损伤。高脂老鼠体内肠道菌群失调，DCA含量增加，UDCA水平下降可以进一步造成粘膜屏障功能受损[48]。哺乳动物体内的胆汁酸调节是一个复杂的过程，需要肝脏、肠道、肠道菌群的共同作用[49]。Kai He等[50]发现黄连可以降低高脂大鼠体内TC、TG、LDL-C、总胆汁酸和脂多糖的水平，增加肠道菌群中粪产碱杆菌和嗜黏蛋白阿克曼氏菌的丰度，抑制大肠杆菌、脱硫弧菌、吉氏副拟杆菌丰度。

3 结语

AD俗称老年性痴呆症，是一种神经退行性疾病，多发于老年人。据报道，目前我国老年人口已达到1.44亿人，其中65岁以上每20人就有1人患老年痴呆，近1000万的患病人群，占世界患病总人数的1/4。目前市场上用于治疗AD的药物有盐酸多哌齐（安理申）1997；卡巴拉汀2000；加兰他敏2001；美金刚2003，多数为乙酰胆碱酯酶抑制剂。而关于AD发病的机制尚不明确可能涉及的环节有:β-淀粉样蛋白堆积，tau-蛋白过度磷酸化，自由基和氧化应激，免疫炎症反应，中枢胆碱能异常，脂质代谢紊乱，钙稳态失调等，因此寻找一个多环节干预治疗AD的药物迫在眉睫。而这正与中药复方具有整体调整、综合施治、多靶点治疗的优点相吻合。黄连解毒汤以其多成分梯次发挥疗效、通过炎症表征因素（促炎症消退介质、促炎及抗炎因子）与胆固醇生物合成代谢多环节干预、整体改善调节、使得炎症微环境及胆固醇甾体类代谢达到新的平衡，实现AD患者病理特征[脑内神经元缠结（neurofibrillary tamgles,NFT）、老年斑（senile plaques,SP）、tau-蛋白磷酸化]及认知功能改善。因此黄连解毒汤有望成为治疗AD的“新星”，但关于其发挥疗效的作用机制需要进一步的深入研究。