整合素介导的力化学信号转导通路对关节软骨修复作用机制的研究进展

张婷婷 李雪萍

关节软骨细胞作为一种力效应细胞，接受应力刺激并产生力学信号，调控基因表达以及组织和细胞的生长发育[1]。软骨细胞的力效应取决于机械负荷的多种因素，例如：频率、应变率、载荷时间关系曲线图、幅度等。一方面，适宜的力学刺激对于维持软骨细胞的生理功能起着重要的作用，另一方面，异常的应力刺激可导致并加重软骨细胞退行性变[2]。肥胖、关节不稳、关节负荷的增加所导致的生物力学改变，是诱发关节软骨退行性变的常见重要因素[3]。研究发现，异常的应力刺激可以导致软骨细胞凋亡、软骨外基质表达降解等一系列病理改变[4-5]。承受超过生理负荷 20% 以上对软骨细胞外基质并无刺激生长作用，但是静态、低频率负荷也会抑制细胞外基质的合成[6]。与此同时，特定形式的力学刺激，如低强度脉冲超声、周期性压力负荷、流体静压等力学刺激又可以起到保护关节软骨的作用[7-8]。近年来研究发现，整合素作为关节软骨表面的机械敏感受体，充当着外界力学信号向细胞内化学信号的转换器作用，介导着外界各种应力刺激，并最终引起细胞内相关信号发生改变[9-10]。其介导的外界应力的软骨细胞修复作用涉及了抑制软骨细胞外基质的降解、增加细胞外基质合成、抑制软骨细胞凋亡、促进软骨细胞增殖与迁移、抑制炎症及疼痛相关因子表达等一系列机制[11-12]。分析整合素介导的力化学信号转导途径，即关节软骨表面力学刺激信号向细胞内转导的途径，以及探讨适宜形式的力学刺激对于关节软骨的修复作用机制，对于进一步了解力学刺激对软骨细胞的修复机制具有重要的参考价值。现就近年来关节软骨细胞表面整合素介导的各种力化学转导途径对于软骨细胞修复作用可能机制的研究进展综述如下，以为骨性关节炎的治疗和软骨组织工程学研究提供新思路。

一、整合素概述

整合素是关节软骨表面的主要应力受体之一，其化学本质为细胞黏附分子，由 α 和 β 两种亚基构成的异二聚体，人类细胞表面可以表达 18 种 α 亚基和 8 种 β 亚基，不同类型的亚基可以组成多达 24 种的整合素[13]，正常人类关节软骨可以表达 α1β1，α3β1，α5β1，α10β1，αVβ1，αVβ3 及 αVβ5 等不同亚型，而骨性关节炎患者会异常表达 α2β1，α4β1，α6β1 等亚型，整合素的胞外结构可与 II 型胶原、VI 型胶原、纤连蛋白等细胞外基质结合，这些细胞外基质成分可将外界应力刺激传递到整合素，同时整合素的胞内结构可与细胞内 FAK ( focal adhesion kinase )、ERK ( extracellular signal-regulated kinas )、JNK( c-Jun N-terminal kinase )、p38 ( p38 mitogen-activated protein kinase ) 等酶类及细胞内踝蛋白、桩蛋白、张力蛋白、肌动蛋白等细胞骨架蛋白发生偶联，并且将外界应力刺激信号转化为细胞内信号，进而引起细胞内的一系列级联反应，实现力化学信号转导过程[10,14-15]。目前研究认为，不同亚型的整合素可能在力化学信号转导过程中扮演着不同的角色，其中 α5β1，α1β1，α2β1，α10β1 及 α3β1等整合素亚型在软骨细胞的力化学转导过程中，主要参与了正常软骨细胞的生长、分化、黏附、迁移等多种生理过程，而骨性关节炎软骨细胞会高表达 β1 亚基及所有类型的 α 亚基[13]，整合素参与了骨性关节炎的病理过程，并与骨性关节炎软骨细胞外基质表达、炎症因子、细胞增殖、血管形成等密切相关[16-19]。近年来研究发现，多种形式的外界应力刺激，均可以通过激活软骨细胞表面的整合素起到修复软骨作用[20]。而这些经整合素途径的力化学转导得到了较为广泛的研究，并且被证明在外界应力下促进软骨修复过程中发挥了重要的作用，并为骨性关节炎的治疗和软骨组织工程学的发展提供了新思路。

二、整合素介导的软骨修复作用机制

1. 整合素介导的低强度脉冲式超声 ( low intensity pulsed ultrasound，LIPUS ) 软骨修复作用机制：LIPUS 一般指强度 1～50 mW / cm2，频率 1～3 MHz 的脉冲式超声波，目前多数研究常用处方为 30 mW / cm2、1～1.5 MHz、20 min / 天[21]。Cheng 等[18]研究发现，应用 40 mW / cm2、3 MHz、通断比 20% 的低强度脉冲超声照射体外培养的兔膝关节软骨细胞，超声治疗组整合素 β1 显著上调，同时其下游 FAK-PI3K ( phosphatidylinositol-3-kinase ) / Akt( serine / threonine-protein kinase ) 化学信号通路激活，金属蛋白酶 MMP-1 ( matrix metallopeptidase-1 )、MMP-13 的表达显著降低，从而抑制细胞外基质的水解，促进兔膝骨性关节炎软骨细胞外基质 II 型胶原、蛋白多糖的表达，提示 LIPUS 经过整合素 β1-FAK-PI3K / Akt 化学信号通路起到了软骨保护作用。进一步研究将 3 MHz、通断比 20%的 LIPUS 的作用强度分为 20 mW / cm2、30 mW / cm2、40 mW / cm2、50 mW / cm24 种不同强度，分别照射正常兔膝关节软骨细胞和兔膝骨性关节炎软骨细胞。结果发现，LIPUS 可以降低正常软骨细胞 MMP-13 的表达，从而抑制细胞外基质的降解，其中以 40 mW / cm2的强度作用效果最为明显，对于兔膝骨性关节炎软骨细胞，30 mW / cm2强度的 LIPUS 软骨修复作用最为明显。该研究提示LIPUS 不仅可以治疗骨性关节炎，同时对于骨性关节炎的发生起到保护作用，并且发现整合素可以介导低强度脉冲超声的力学刺激信号，调控关节软骨内 p38 MAPKs( mitogen-activated protein kinases ) 信号通路，促进金属蛋白酶 MMP-13 的下调，减少 II 型胶原的水解，从而起到保护关节软骨的作用[17]。但是，对于晚期的兔膝骨性关节炎模型，低强度脉冲超声治疗组与骨性关节炎模型组相比，MMP-13 的改变不具有统计学意义。而对于早期骨性关节炎模型组与超声治疗组，经过超声治疗后，整合素介导的 FAK-MAPKs 通路明显激活，MMP-13 表达显著降低，且具有统计学意义 ( P＜0.05 )，提示整合素介导的FAK-MAPKs 通路主要对早期骨性关节炎有保护作用[22]。同时也有研究发现整合素 β1 可以介导 LIPUS 对骨性关节炎骨软骨软连接处的血管形成与结构重塑，目前已知该处的血管形成与结构重塑已经被证明是促进骨性关节炎退行性的主要因素[23]，LIPUS 通过激活整合素引起细胞内级联反应最终促进抗血管形成因子 ChM-1 ( chondromodulin-1 )的表达，抑制促血管形成因子 VEGF ( vascular endothelial growth factor ) 的表达，从而缓解骨软骨连接处血管形成与侵袭，抑制骨性关节炎骨软骨连接处结构重塑，最终起到关节软骨保护作用[19]。

还有研究发现，下颌骨髁突软骨细胞与 IL-1β( interleukin-1β ) 共培养，其环氧化酶 2 ( COX-2 ) 相关 mRNA 表达显著增加，予以 LIPUS 照射后，整合素β1-ERK1 / 2 通路激活，COX-2 相关 mRNA 显著下降，提示下颌骨 LIPUS 可以通过整合素 β1-ERK1 / 2 通路抑制下颌骨髁突软骨炎症反应[24]。也有研究显示 LIPUS 通过抑制人类关节软骨细胞炎症相关因子 IL-1β 表达，促进间充质干细胞向软骨细胞分化，但是该作用机制是否与整合素相关，仍有待进一步研究[25]。

总之，整合素 β1 可以被 LIPUS 激活，并且引起整合素 β1-FAK-PI3K / Akt ( PI3K / Akt )、整合素 β1-FAKMAPK ( p38 / JNK )、整合素 β1-ERK1 / 2 通路等多条力化学转导通路发生激活，进而通过抑制细胞外基质金属蛋白酶的表达、促进细胞外基质的表达、抑制骨性关节炎骨软骨连接处结构重塑与血管形成、抑制炎症相关因子等多种途径促进关节软骨的修复。目前研究发现 LIPUS 可以促进间充质干细胞向软骨细胞分化[26]，但其是否与整合素介导的信号通路相关仍然需要进一步探索。

2. 整合素介导的周期性压力负荷的软骨修复作用机制：周期性压力负荷是指发生周期性改变的压力负荷，其广泛应用于软骨组织工程学的研究中，大量研究提示予以三维培养基培养的关节软骨以特定形式的周期性压力刺激，整合素相关力化学转导通路可被激活，软骨细胞外基质的合成以及软骨细胞增殖发生明显改变[20,27-28]。

近年有研究发现，周期性负荷压力通过整合素介导的软骨修复作用与磷脂酶 C-γ1 ( phospholipase C-γ1 protein，PLCγ1 ) 密切相关，PLCγ1 是磷脂酶 C 家族成员之一，普遍存在于多种细胞中，对于调控细胞的黏附、迁徙、细胞外基质合成具有重要作用[29-30]。Nong 等[31]研究发现，应用周期性大气压力负荷 ( 0～200 kPa，0.1 Hz ) 作用于密闭培养环境下的软骨细胞，发现 Src 蛋白、PLC-γ1、ERK1 / 2发生了显著的磷酸化水平增高，同时周期性负荷压力治疗组软骨细胞发生了明显的迁徙，加入 PLC-γ1 抑制剂共培养后，再予以周期性压力，软骨细胞面积和迁徙程度也发生了显著减少，从而提示周期性负荷压力可以促进软骨细胞迁徙，并且 Src / PLC-γ1 / ERK1 / 2 通路可能参与了这一作用机制。进一步研究发现，周期性负荷压力( 0.2 MPa；0.1 Hz ) 作用下，整合素 α1 也发生了上调，并且与 PLC-γ1 发生偶联，从而提示整合素 α1 作为细胞表面的力化学转化器，介导了外界周期性负荷压力通过调控PLC-γ1 引起细胞发生迁徙及细胞外基质表达增加[32]。Ren等[33]研究发现，应用周期性空气压力负荷 ( 0～200 kPa，0.1 Hz ) 作用于大鼠软骨细胞，可明显促进软骨增殖和细胞外基质表达，应用软骨细胞与抑制剂共培养的方法发现，MEK1 / 2 ( mitogen-activated protein kinase1 / 2 )、ERK1 / 2 选择性抑制剂 PD98059 可以显著降低力学刺激引起的软骨细胞增殖和细胞外基质的表达，但是其上游的 Src 和 PLC-γ1 的磷酸化水平并没有受到抑制，而使用PLC-γ1 抑制剂 U73122，Src 的磷酸化水平未受到影响，MEK1 / 2、ERK1 / 2 的磷酸化受到抑制，使用 Src 抑制剂后，PLC-γ1，MEK1 / 2、ERK1 / 2 的磷酸化水平均受到了抑制，从而提示 Src-PLC-γ1-MEK1 / 2-ERK1 / 2 信号通路参与了周期性负荷压力介导的软骨细胞增殖与细胞外基质表达的增加。进一步研究，整合素 β1 参与了这一作用机制，从而提示外界的周期性负荷压力通过整合素β1-Src-PLCγ1 / Rac1-ERK1 / 2 力化学转导信号通路激活了 ERK1 / 2，从而促进了体外培养的软骨细胞的有丝分裂[34]。Liang 等[35]通过基因工程手段，上调了体外培养的软骨细胞整合素 β1 的表达，再应用周期性空气压力负荷( 0～200 kPa，0.1 Hz ) 予以力学刺激，发现整合素 β1 过表达实验组在力学刺激作用下，发生了明显的 ERK1 / 2 磷酸化上调，其 II 型胶原及蛋白多糖明显增加，软骨细胞也发生了增殖，从而说明整合素 β1 在介导外界应力引起的软骨细胞修复过程中起到重要作用。此外研究发现，周期性空气压力负荷 ( 0～200 kPa，0.1 Hz )，至少通过整合素 β1-Src-Rac1-FAK [ Tyr ( 576 / 577 ) ]-ERK1 / 2 和整合素 β1-FAK [ Tyr ( 397 ) ]-ERK1 / 2 两条通路促进软骨细胞增殖和细胞外基质合成[36]。Song 等[37]研究发现，应用周期性空气压力负荷 ( 0～200 kPa，0.1 Hz ) 作用于大鼠关节软骨，发现整合素 β1 介导的 ERK1 / 2 信号通路激活，软骨细胞发生明显增殖，II 型胶原及蛋白多糖 mRNA 转录明显增加，应用整合素 β1 抑制剂后，ERK1 / 2 信号通路也明显发生抑制，其细胞增殖与细胞外基质合成也受到了抑制，从而提示周期性空气压力负荷可以通过激活整合素β1-ERK1 / 2 信号通路促进细胞增殖与细胞外基质表达。

总之，近年来关于周期性压力负荷对于软骨细胞的作用机制多采用周期性空气压力负荷作用于密封环境下培养的软骨细胞，所用压力参数多为 0～200 kPa，0.1 Hz，大量研究证明周期性空气压力负荷可以激活整合素 α1 和整合素 β1，并且可以通过整合素 α1-PLCγ1 通路、整合素 β1-Src-Rac1-FAK [ Tyr ( 576 / 577 ) ]-ERK1 / 2、整合素 β1-FAK [ Tyr ( 397 ) ]-ERK1 / 2、整合素 β1-Src-PLCγ1 /Rac1-ERK1 / 2 等多种力化学信号转导通路引起细胞发生迁徙、增殖及细胞外基质表达增加，从而起到促进软骨细胞修复作用。

3. 其它力学刺激经整合素途径的软骨修复作用：其它的力学刺激形式，比如自身重力负荷、低强度连续超声、流体静压、延迟动态压力等均可以通过特定形式的刺激作用于软骨细胞，起到促进软骨细胞修复作用，而体外冲击波有可能通过整合素及细胞表面离子通道等多种途径促进软骨细胞修复[38-39]。

在整合素介导自身重力负荷下骨性关节炎的发病机制研究中[40]，通过比较正常小鼠和整合素 α5 基因缄默的小鼠对手术造模后关节活动引起的骨性关节炎的反应，发现整合素 α5 基因缄默的小鼠骨性关节炎病理改变较对照组轻，软骨细胞外基质丢失较正常对照组明显减少，提示整合素 α5 可能介导了自身重力促进骨性关节炎病理改变。Zhang 等[41]通过观察手术所导致的大鼠关节软骨损伤周围处的整合素 β1 阳性的细胞，发现其与空白对照组和假手术组 ( 仅做关节切开缝合 ) 相比，整合素 β1 阳性的细胞计数明显增加，提示整合素 β1 可能介导了损伤软骨周围细胞的增殖和迁徙。Shin 等[42]研究发现，整合素 α1β1 可以通过介导下调 EGFR ( epidermal growth factor receptor ) 信号通路，对创伤后骨性关节炎的雌性小鼠起到软骨保护作用，但对于雄性小鼠的保护作用不显著，其性别差异原因不明。

低强度连续超声区别于 LIPUS，其主要对关节软骨产生持续性大强度力学刺激，研究发现，该类型的低强度超声照射，也可以激活整合素－MAPK / Erk 通路，此外，有研究还观察到了 FAK、Src、P139Cas ( p130 Crk-associated substrate )、CrkII 的磷酸化水平增加[8]。

Steward 等[43]应用流体静压可以促进培养在琼脂糖凝胶中的骨髓源间充质干细胞向软骨细胞分化，应用整合素抑制剂精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－丝氨酸结合序列 ( Arg-Gly-Asp-Ser，RGDS ) 后，流体静压促进软骨分化的效应明显受到抑制，提示整合素在介导外界应力刺激促进骨髓源间充质干细胞向软骨细胞分化的过程中起到重要作用。

Zhang 等[44]研究发现，在延迟动态压力作用于培养在凝胶支架上的人软骨细胞，整合素 / FAK / ERK 参与了压力刺激对于间充质干细胞向软骨细胞分化和软骨组织形成的过程，延迟动态压力可以同时激活 TGF-β ( transforming growth factor-beta ) / Activin / Nodal 信号通路并且抑制 BMP( bone morphogenetic protein ) / GDP ( Guanosine diphosphate )信号通路。

Ji 等[45-46]结合既往关于各种力学刺激对于软骨细胞修复的作用机制研究提出假设，特定形式的体外冲击波也可以通过整合素、细胞表面离子通道等途径促进软骨细胞修复，但是具体机制仍然有待进一步研究。

总之，整合素 α5 及整合素 β1 可能参与了软骨损伤后，自身重力负荷下的自我修复。低强度连续超声可通过整合素－MAPKs / Erk 力化学通路促进软骨修复，特定形式的流体静压及延迟动态压力可通过整合素途径刺激促进骨髓源间充质干细胞向软骨细胞分化，体外冲击波也可通过整合素途径促进软骨细胞修复，但其具体机制仍需深入研究。

综上所述，软骨细胞表面整合素介导的力化学通道可参与包括 LIPUS、周期性压力负荷、自身重力负荷、低强度连续超声、流体静压、延迟动态压力、体外冲击波等多种力学刺激促进软骨修复，其机制涉及了促进软骨细胞外基质合成、减少软骨细胞外基质的降解、抑制软骨细胞凋亡、促进软骨细胞增殖与迁移、促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化、抑制软骨下骨血管形成与结构重塑等多种形式。然而由于在体软骨细胞具有不可再生性和自我修复有限性，目前仍缺乏效果满意的软骨刺激形式。因此，笔者综合讨论经整合素途径介导的各种力学刺激对于软骨细胞的修复作用以及寻求最佳力学刺激方式，同时了解力学刺激对于软骨细胞生长、代谢所起到的作用。而目前研究仍局限于经整合素途径的力学刺激的强度和形式的研究，尚未对所引起的化学信号激活阈值以及是否具有反馈机制进行探讨。因此，进一步探讨化学信号是否反馈抑制或激活力学刺激作用而引起软骨细胞内环境的改变，将为软骨细胞修复提供新的思路和潜在的治疗手段，同时也为软骨组织工程学技术提供软骨修复和再生的新思路。

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