凤仙花的指纹图谱研究及2种1,4-萘醌成分的含量测定

王 芳,王宝华,丁 磊,董洁洁,周广义,孟庆卿,季文琴

(北京中医药大学中药学院,北京 100102)

凤仙花(ImpatiensbalsaminaL.)为凤仙花科(Balsaminaceae)凤仙花属(Impatiens)1年生草本植物。作为观赏性植物,凤仙花在国内外均有种植,其花、茎、叶和种子在民间具有悠久的药用历史,其中《中国药典》2010年版收载其种子急性子作为药用部位[1-2]。凤仙花中含有黄酮类、1,4-萘醌类和有机酸等多种化学成分[3]。其中,指甲花醌(HNQ)和指甲花甲醚(MeONQ)是其主要的1,4-萘醌类成分[4-5]。研究表明,凤仙花中的指甲花醌具有抗菌和抗变态反应活性[6],指甲花甲醚具有抗菌、抗胃腺癌、抑制乳腺癌细胞转移[7]及抗肿瘤[8-10]等活性。在民间,人们用醋、酒泡凤仙花进行染发或治疗灰指甲[11]。研究表明,灰指甲是由皮肤真菌引起的疾病[12],而指甲花醌和指甲花甲醚又是凤仙花抗真菌的主要活性成分[13]。对此,本实验建立凤仙花的HPLC指纹图谱用于凤仙花的质量控制,同时对10批不同产地凤仙花中的2种1,4-萘醌类成分进行研究,为提高凤仙花的质量评价、控制及进一步的开发利用提供参考[14]。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪,包括四元泵、DAD检测器、在线脱气机、LC1200中文工作站(日本岛津公司)；BY-G18型微量高速离心机(北京白洋医疗器械有限公司)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BT25S型电子分析天平(上海荆和分析有限公司)；0.45 μm微孔滤膜(天津市津腾实验设备有限公司)。

1.2试药 指甲花醌对照品(批号50325)、指甲花甲醚对照品(批号MKBJ4863V),均购自北京万佳首化生物科技有限公司；乙腈(批号164788)、乙酸(批号127097)均为色谱纯,购自赛莫飞世尔科技有限公司；乙醇为分析纯(批号20160906)，北京化工厂；凤仙花干品10批(自采或购于河南和安徽等地),具体来源见表1,经北京中医药大学石晋丽教授鉴定为凤仙花科(Balsaminaceae)凤仙花属(Impatiens)凤仙花(ImpatiensbalsaminaL.)的花。

表1凤仙花样品来源

Tab.1 The origin of theImpatiensbalsaminaL.samples

样品编号产地备注S1河南省南阳市1号农家自种自采S2北京市学校自种自采S3河南省南阳市2号农家自种自采S4江西省赣州市1号农家自种自采S5江西省赣州市2号农家自种自采S6安徽省药店S7安徽省亳州市药店S8河南省上海义草堂药店S9河南省南阳市3号农家自种自采S10河南省南阳市4号农家自种自采

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱Agilent TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为乙腈(A)-10 mL·L-1乙酸(B)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：280 nm；梯度洗脱(0～10 min,20%～25%A；10～20 min,25%～35%A；20～30 min,35%～45%A；30 min～40 min,45%～20%A)。混合对照品和供试品的HPLC图见图1。

图1HPLC图

1.混合对照品；B.供试品；1.指甲花醌；2.指甲花甲醚。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixed reference substances；B.sample；1.lawsone；2.2-methoxy-1,4-naphthoquinone.

2.2混合对照品溶液的制备 分别精密称取指甲花醌及指甲花甲醚对照品10.0和20.0 mg,置于同一25 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备 精密称取凤仙花药材粉末(过40目筛)0.50 g,置于50 mL离心管中,加入体积分数为40%的乙醇10 mL,超声提取,提取条件为：超声功率210 W,提取温度40 ℃,提取30 min。将提取液以10 000 r·min-1离心20 min,吸取上清液,再次离心20 min,用0.45 μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液。

2.4方法学考察

2.4.1线性关系 精密量取对照品溶液0.1,0.2,0.5,1.0,2.5和5.0 mL,分别置于10 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,得系列质量浓度的溶液。按照2.1项下色谱条件进样10 μL,测定峰面积。以对照品质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线,计算回归方程及相关系数,得指甲花醌和指甲花甲醚的回归方程分别为y=526 228 699.87x+106 418.24(r=0.999 3)和y=48 612 540.85x+305 337.13(r=0.999 6),结果表明,2种成分质量浓度分别在0.004～0.400和0.008～0.800 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.4.2精密度实验 精密称定同一批次凤仙花药材粉末0.50 g,按照2.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1项下色谱条件进样10 μL,重复进样6次,测定峰面积,计算得指甲花醌和指甲花甲醚的峰面积RSD值分别为1.04%和1.41%。结果表明,该仪器精密度良好。

2.4.3重复性实验 精密称定同一批次凤仙花药材粉末6份,每份0.50 g,按照2.3项下方法制备供试品溶液,每次进样10 μL,测定峰面积,计算得指甲花醌和指甲花甲醚的峰面积RSD值分别为1.68%和1.03%。结果表明,该方法重复性良好。

2.4.4稳定性实验 精密称定同一批次凤仙花药材粉末6份,每份0.50 g,按照2.3项下方法制备成供试品溶液,按照2.1项下色谱条件每次进样10 μL,分别于0,2,4,6,8,10和12 h依次进样,测定峰面积,计算RSD值。结果显示,指甲花醌和指甲花甲醚的峰面积在10 h内的RSD值分别为1.75%和0.93%。结果表明,供试品溶液在10 h内基本稳定。

2.4.5加样回收率实验 精密称定同一批次凤仙花药材粉末6份,每份0.50 g,加入指甲花醌和指甲花甲醚的对照品溶液,按照2.1项下色谱条件进样10 μL,测定峰面积,计算RSD值。结果显示,指甲花醌和指甲花甲醚的平均回收率分别为98.56%和102.75%,RSD值分别为1.92%和1.96%。结果表明,该方法的回收率良好。见表2。

表2加样回收率实验结果

Tab.2 Results of recovery test (n=6)

2.5凤仙花HPLC指纹图谱的建立与分析

2.5.1凤仙花指纹图谱的测定 取10批不同产地的凤仙花粉末各0.50 g,精密称定,按照2.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1项下色谱条件依次进样分析。将10批凤仙花指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”,选取时间窗宽度为0.1 min,以平均值生成对照谱图,经过多点校正后自动匹配,得到指纹图谱及共有模式对照指纹图谱,见图2～3。结果显示,共有模式指纹图谱中标定10个共有峰,构成凤仙花指纹图谱的特征峰,其中,利用对照品证明8号峰为指甲花醌,9号峰为指甲花甲醚。

图210批凤仙花的HPLC指纹图谱

8.指甲花醌；9.指甲花甲醚。

Fig.2 HPLC fingerprints of 10 batches ofImpatiensbalsaminaL.

8.lawsone；9.2-methoxy-1,4-naphthoquinone.

图310批凤仙花药材的HPLC指纹图谱共有峰

8.指甲花醌；9.指甲花甲醚。

Fig.3 10 characteristic common peaks in HPLC fingerprints ofImpatiensbalsaminaL.

8.lawsone；9.2-methoxy-1,4-naphthoquinone.

2.5.2相对保留时间和相对峰面积分析 通过保留时间定性可知,9号峰为指甲花甲醚的色谱峰,该峰分离度较高、峰形较好、峰面积值所占比例较大且出峰保留时间相对稳定,将其定为参照峰,设其相对保留时间和相对峰面积为1,计算共有峰对它的相对保留时间和相对峰面积,结果见表3～4。由表3～4可知,10批凤仙花共有峰相对保留时间的RSD值差异较小,而各特征峰相对峰面积的RSD值相差较大,说明凤仙花品种成分种类相近,但含量差别较明显,因此有必要建立相应指纹图谱和特征峰的含量测定,以提高药材的质量标准[15]。

表3凤仙花共有峰的相对保留时间

Tab.3 Relative retention time of common peaks ofImpatiensbalsaminaL.

峰号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10xRSD/%10.1120.1130.1120.1120.1120.1120.1120.1120.1120.1120.1120.4020.1260.1260.1260.1270.1250.1260.1250.1260.1250.1260.1260.4830.1370.1370.1370.1370.1370.1370.1370.1370.1370.1370.1370.0440.1530.1530.1530.1530.1540.1530.1530.1530.1530.1530.1530.1950.1680.1680.1680.1680.1680.1680.1680.1680.1680.1680.1680.0360.4560.4560.4580.4560.4550.4540.4550.4530.4540.4550.4550.2770.5380.5380.5410.5380.5380.5370.5380.5350.5370.5370.5380.2780.7400.7410.7430.7410.7400.7380.7390.7370.7390.7390.7390.2391.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00101.2501.2511.2531.2521.2511.2481.2491.2471.2491.2501.2500.14

表4凤仙花共有峰的相对峰面积

Tab.4 Relative peak area of common peaks ofImpatiensbalsaminaL.

峰号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10xRSD/%10.0890.1040.1470.1200.2170.1520.1280.1520.2190.3190.33620.4820.1480.3340.2660.3500.3430.2490.1860.2500.4230.6910.51829.4630.1070.2090.2230.2580.3160.2380.1620.2460.2970.6290.34340.9240.0290.0580.0590.0880.0760.0530.0400.0560.0830.1690.4598.4750.1320.2530.3010.2260.3940.2790.2020.2370.2280.6390.43332.3960.4850.3330.4380.4660.6150.5020.3790.4700.7241.0230.36555.2870.4210.6360.3331.1820.4100.4090.2200.6510.8211.9190.70072.9680.5541.8000.1650.4080.0550.3040.1160.4540.0962.1510.610121.6191.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00100.3970.4550.4960.4950.9060.4610.4210.4900.7330.5600.54129.28

2.5.3相似度分析 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”,以S1号批次(河南省南阳市1号)对10批样品的色谱进行比较分析,结果见表5。由表5可知,10批药材中7个批次的药材与对照指纹图谱间的相似度大于0.9,3个批次药材与对照指纹图谱间的相似度在0.837～0.957之间。

表5样品特征图谱与共有特征图谱R的相似度

Tab.5 The results of similarity between specific chromatogram and common specific chromatogramR

样品编号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10对照指纹图谱S11.0000.8510.8880.8990.8290.9120.8590.8920.8580.7410.957S20.8511.0000.6610.7560.5880.7310.6330.7720.6330.7750.839S30.8880.6611.0000.8360.9530.9620.9070.9050.8800.7350.939S40.8990.7560.8361.0000.8090.8670.7960.8920.9280.7490.930S50.8290.5880.9530.8091.0000.9390.9000.8780.9000.6940.906S60.9120.7310.9620.8670.9391.0000.9460.9620.8920.7770.972S70.8590.6330.9070.7960.9000.9461.0000.9100.8840.5570.896S80.8920.7720.9050.8920.8780.9620.9101.0000.8880.7980.969S90.8580.6330.8800.9280.9000.8920.8840.8881.0000.6210.907S100.7410.7750.7350.7490.6940.7770.5570.7980.6211.0000.837对照指纹图谱0.9570.8390.9390.9300.9060.9720.8960.9690.9070.8371.000

2.6不同产地凤仙花药材含量测定 将购于不同产地的10批凤仙花药材除杂,粉碎,过40目筛,分别精密称定粉末0.50 g,按照2.3项下供试品溶液的制备方法进行制备,平行3组,得待测样品。在2.1项色谱条件下进样分析,得到峰面积后,计算指甲花醌和指甲花甲醚的含量。结果见表6。

表610批凤仙花中2种1,4-萘醌类的含量测定结果

Tab.6 The contents of 2 kinds of 1,4-naphthoquinone in 10 batches ofImpatiensbalsaminaL. (mg·g-1,n=3)

样品编号指甲花醌指甲花甲醚S10.30375.8813S20.73864.3398S30.05843.9693S40.13813.6419S50.01132.8330S60.11404.0343S70.02464.2249S80.13024.4739S90.02182.8529S100.24711.7849

3 讨论

中药质量控制研究是保证中药安全性和有效性的关键环节,多指标定量测定已成为中药质量控制较为常用的方法之一[16]。本研究采用HPLC法对北京市、河南省、安徽省等10个不同产地凤仙花的指纹图谱进行研究并对其含有的2种1,4-萘醌类成分进行含量测定。指纹图谱中共有峰的相对保留时间基本一致,差异主要表现为各共有峰相对峰面积差异显著,相似度分析结果显示相似度跨度较大。同时,以指甲花醌和指甲花甲醚为主要特征成分的含量测定结果也显示，不同地区凤仙花中2种1,4-萘醌类成分的含量差异明显,表明不同产地凤仙花药材质量有优劣之分。由此推测,药材质量优劣差异可能与药材资源的多样性、药材采收年限、采收时间和贮存时间引起的化学成分变化和温度等因素有关[17-18]。

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