卒中T淋巴细胞亚群动态变化及其与卒中相关感染的关系

赵博，杨彬彬，王佳伟

2006年，Vargas等[1]提出卒中相关性感染（stroke associated infection，SAI），将其定义为卒中发病时无感染且不处于感染潜伏期，卒中发病后7 d内发生的感染，以肺部感染和泌尿系感染为主[2]，其发生率为23%～65%，往往会加重病情并影响预后[3]。卒中会打破神经系统与免疫系统之间的平衡，诱导产生外周免疫抑制综合征（stroke induced immunodepression syndrome，SIDS）[4]，主要表现为广泛的淋巴细胞凋亡和功能障碍，从而导致感染发病率增加[5]。T淋巴细胞在卒中后机体免疫应答中起关键作用[6-7]，CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞主要介导细胞免疫，CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）具有免疫抑制作用，包括调节免疫炎症反应、限制病变发展和促进组织修复等[8-9]。卒中后各T淋巴细胞亚群时间和空间的分布更有助于阐明他们在卒中病理生理过程中的作用，然而目前对于该问题仍存在争议。本研究通过观察卒中早期患者外周血中CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞及Tregs动态变化，进一步揭示卒中急性期免疫变化相关机制，以及免疫异常对于卒中后感染的影响，为发现新的卒中治疗靶点及卒中后感染的预防和治疗提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2014年11月-2015年1月在首都医科大学附属北京同仁医院神经内科住院治疗的卒中患者为卒中组。

入组标准：①年龄≥18岁；②发病24 h内入院；③符合2013年由美国心脏学会（American Heart Association，AHA）/美国卒中学会（American Stroke Association，ASA）的《急性缺血性卒中诊治指南》[10]及2010年《自发性脑出血治疗指南》[11]中缺血性卒中和脑出血诊断标准，并经头部计算机断层扫描（computed tomography，CT）或磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）证实；④入院当天美国国立卫生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）评分≥3分，且卒中前改良Rankin量表（modi fi ed Rankin Scale，mRS）评分≤2分。

排除标准：①痛风、血液系统疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤；②严重肝、肾功能障碍；③急性心肌梗死及其他血管栓塞性疾病；④甲状腺功能亢进及其他慢性消耗性疾病；⑤发病前2周内有感染史、服用雌激素或2周内有外科手术或外伤。

同期无神经系统症状和体征的健康体检者作为对照组。

本研究经首都医科大学附属北京同仁医院伦理委员会批准，所有受试者或其家属均签署知情同意书。

1.2 感染诊断标准及分组 卒中相关性肺炎的诊断标准：临床诊断：卒中发生后胸部影像学发现新出现或进展性肺部浸润性病变，同时合并2个以上临床感染症状：①发热≥38℃；②新出现的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病症状加重，伴或不伴胸痛；③肺实变体征和（或）湿啰音；④外周血白细胞≥10×109/L或≤4×109/L，伴或不伴核左移。病原学诊断：患者咳深部痰进行细菌定量培养，同时排除某些与肺炎临床表现相近的疾病如肺结核、肺部肿瘤、非感染性肺间质病、肺水肿、肺不张、肺栓塞等[12]。卒中后泌尿系感染的诊断标准：①临床表现：有发热、尿频、尿急、尿痛、耻骨上区不适和腰骶部疼痛等症状可做出临床诊断；②尿培养：清洁中段尿培养，菌落计数女性＞105CFU/ml、男性＞104CFU/ml，或导尿患者留取的尿标本细菌菌落计数＞104CFU/ml[13]。

根据发病1周内有无感染，将患者分为感染组和非感染组。

1.3 主要试剂与仪器 3色淋巴细胞亚群试剂CD4/CD8/CD3单克隆抗体（单抗）、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的小鼠抗人CD4单抗、别藻青蛋白（allophycocyanin，APC）标记的CD25单抗和同型对照Mouse γ1、藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）标记的FoxP3单抗和同型对照IgG2a，以及溶血素、FoxP3固定/破膜/洗液，均购自美国BD公司。流式细胞仪购自美国BD公司，分析软件为Cell Quest Pro系统。

1.4 流式细胞仪检测 卒中组于发病24 h内、3 d和7 d采取2 ml四乙酸二氨基乙烷（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝的外周静脉血，对照组于清晨空腹状态下采集2 ml EDTA抗凝的外周静脉血。标本分装为2份，分别于检验科检测血常规及在中心实验室应用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群，标本均于采集后24 h内测定。

流式细胞术操作方法：①CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+T细胞：取抗凝全血100 μl，加入5 μl CD4/8/3单克隆抗体，振荡器上充分混匀，室温避光反应25 min；加入溶血素1 ml，充分震荡混匀，室温避光10 min，1500 r/min离心5 min弃上清液，加1 ml磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗1次弃上清液，加0.5 ml PBS，振荡器上充分混匀，立即上流式细胞仪检测。②CD4+CD25+FoxP3+Tregs：取抗凝全血100 μl，实验组加入CD25-APC 3 μl、CD4-FITC 10 μl，对照组加入IgG1-APC 3 μl、CD4-FITC 10 μl，振荡器上充分混匀，室温避光反应15 min；加入FoxP3固定/破膜液1 ml，充分震荡混匀，室温避光反应30 min，加入FoxP3破膜洗液1 ml，1500 r/min离心5 min洗两次，弃上清液；实验组和对照组分别加FoxP3-PE 5 μl、IgG2-PE 0.5 μl，充分震荡混匀，室温避光孵育2 h，加0.5 ml PBS，振荡器上充分混匀，立即上流式细胞仪检测。

CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞亚群绝对值计算：血常规测得淋巴细胞绝对值×流式细胞术测得相应细胞比例；CD4+CD25+FoxP3+Tregs淋巴细胞亚群绝对值计算：血常规测得淋巴细胞绝对值×流式细胞术测得CD3+CD4+T淋巴细胞比例×CD4+CD25+FoxP3+Tregs比例。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料数据均符合正态分布，以表示，卒中组与对照组样本间采用完全随机设计方差分析进行检验，非感染组与感染组采用两独立样本t检验进行检验。计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 研究期间连续入组32例卒中患者（缺血性卒中24例，脑出血8例）。所有患者均于发病24 h内就诊，缺血性卒中患者中有2例在症状出现4.5 h内接受了重组组织型纤溶酶原激活物（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）静脉溶栓治疗。卒中后非感染组24例（缺血性卒中19例，脑出血5例），卒中后感染者8例（缺血性卒中5例，脑出血3例）。感染分别发生在发病后2 d至4 d，其中2例有明确的病原学结果，且均为痰培养草绿色链球菌阳性。对照组23例，卒中组与对照组年龄、性别、吸烟、饮酒、糖尿病、高脂血症、心房颤动史等方面无显著差异，但卒中组高血压病史、冠状动脉粥样硬化性心脏病病史、卒中病史及感染发生率均显著高于对照组（表1）。

表1 卒中组与健康对照组样本资料统计

2.2 健康对照组与卒中后非感染组及卒中后感染组各淋巴细胞亚群绝对值比较 健康对照组CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+T淋巴细胞亚群绝对值分别为（1.25±0.43）×109/L、（0.67±0.24）×109/L和（0.59±0.28）×109/L，CD4+CD25+FoxP3+Tregs淋巴细胞亚群绝对值为（0.05±0.03）×109/L。与健康对照组比较，卒中后非感染组CD3+CD4+T细胞与Tregs于发病后7 d升高（P分别为0.02和0.03）；CD3+CD8+T细胞在发病后24 h及3 d下降（P分别为0.01和0.03），发病后7 d升至与健康对照组无显著差异。卒中后感染组CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞及Tregs在发病24 h内（P分别为＜0.001，＜0.001，0.03和＜0.001）、3 d（P均＜0.001）、7 d均较健康对照组明显下降（P分别为＜0.001，0.01，0.01和0.01）（表2）。

表2 卒中后非感染组及卒中后感染组各淋巴细胞亚群绝对值检测结果及比较（×109/L）

2.3 卒中后非感染组与卒中后感染组各淋巴细胞亚群绝对值比较 卒中后感染组CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞及Tregs在发病后24 h内（P分别为0.01，＜0.001和＜0.001）、3 d（P分别＜0.001，＜0.001和0.04）、7 d（P均＜0.001）均显著低于卒中后非感染组；两组CD3+CD8+T细胞在发病后24 h内无明显差异，但3 d（P＜0.001）、7 d（P=0.02）卒中后感染组显著低于卒中后非感染组（表2）。

3 讨论

卒中是一个复杂的全身炎症性疾病及自身免疫过程，其发生发展与体内多种免疫细胞和炎症因子相关，而卒中同样会影响机体的免疫功能。目前认为SIDS实质为神经-内分泌-免疫调节机制，卒中后下丘脑-垂体-肾上腺轴被激活，交感神经系统活动增强，肾上腺皮质激素分泌增加，交感神经末梢释放儿茶酚胺类激素增多，从而致外周血、肝脏、脾脏T淋巴细胞数下降及功能降低[14]。最近研究发现，坏死脑细胞中释放的高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）可直接诱发一系列免疫抑制，包括淋巴细胞减少症[15]。

目前，关于卒中后各T淋巴细胞亚群时间和空间的动态变化仍存在争议。Vogelgesang等[16]发现，脑梗死后外周血C D3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞在发病当天即下降，之后逐渐上升，于发病后14 d恢复至与健康对照组无差异，SAI患者各T淋巴细胞亚群下降较非SAI患者下降更为明显。Urra等[17]发现卒中后外周血CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞及Tregs细胞发病后当天开始下降，第二天降至最低，后逐渐回升；肺部感染者各细胞数明显低于非感染者。国内临床研究发现，于入院后24～48 h抽取急性脑梗死患者外周静脉血，SAI组、非SAI组的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+T淋巴细胞水平均低于健康对照组，CD8+T淋巴细胞水平均高于健康对照组，且SAI组较非SAI组预后不良[18]。T淋巴细胞减少可能作为卒中后感染的一个预测因素[19]。

本研究发现，卒中后非感染者发病后24 h内即出现细胞免疫功能下降，至发病后7 d免疫功能有所恢复，但Tregs在发病后7 d开始增多，发挥其免疫抑制作用。卒中后感染者在发病后24 h内、3 d及7 d细胞免疫功能明显低于非感染者，且T淋巴细胞数量减少早于感染发生时，故推测机体细胞免疫功能下降会增加感染风险。卒中后感染者在发病后3 d细胞免疫功能下降最明显，Tregs的免疫抑制作用可能是其重要原因之一。此外，国内关于感染后机体免疫功能的研究发现，肺部感染患者外周血CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞低于健康对照组，而CD3+CD8+T细胞高于健康对照组[20]。提示感染对于机体免疫状态的影响不容小觑，推测其在卒中后患者感染发生后的T淋巴细胞亚群数量变化中起重要作用。但目前尚缺乏观察感染后机体免疫功能动态变化的动物实验及临床研究。

导致本研究与既往研究结果不完全一致的原因考虑有：样本量（尤其卒中后感染患者）相对较少、患者病情严重程度差异较大、发病危险因素不同、缺血性卒中及脑出血同时纳入、治疗药物对免疫功能影响、观察时间点不同等。进一步的研究需扩大样本量，根据患者病情轻重程度分组，延长指标监测时间，纳入不合并脑血管病的单纯感染患者组等，进一步明确卒中后机体免疫功能变化及其与卒中相关性感染的因果关系，进而阐明相关病理生理机制，为卒中后感染的预防和治疗提供理论支持。

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【点睛】本研究对比了卒中急性期患者在发生感染及无感染两种情况下与健康人群外周血T淋巴细胞亚群的差异，显示了T淋巴细胞亚群的绝对值在卒中急性期及卒中后感染过程中呈动态变化过程。