通心方对冠心病患者外周血内皮祖细胞的影响

刘 征，冯其茂,董耀荣,樊 俊

(1. 上海中医药大学,上海 201203;2.上海中医药大学附属中医医院,上海 200071)

通心方对冠心病患者外周血内皮祖细胞的影响

刘 征1，冯其茂2,董耀荣2,樊 俊2

(1. 上海中医药大学,上海 201203;2.上海中医药大学附属中医医院,上海 200071)

目的探讨通心方治疗冠心病患者疗效及对外周血内皮祖细胞(EPCs)数量、功能的影响。方法将48例冠心病患者随机分成对照组和治疗组，每组24例。对照组在西医常规治疗基础上加服麝香保心丸，治疗组在西医常规治疗基础上加服通心方，2组疗程均为3个月。观察2组治疗前后外周血EPCs数量、功能的变化，统计2组临床疗效。结果治疗3个月后，2组EPCs数量均明显高于治疗前(P均<0.05)，且治疗组明显高于对照组(P<0.05)。对照组EPCs增殖活力OD值从治疗第4天开始明显高于治疗前(P<0.05)；治疗组EPCs增殖活力OD值于治疗第1天开始明显高于治疗前(P<0.05)，从第5天开始出现对数增殖期，且第5—7天明显高于对照组(P均<0.05)。治疗组总有效率明显高于对照组(P<0.05)。结论通心方能刺激冠心病患者骨髓释放更多的EPCs到外周血，能显著提高外周血EPCs的增殖能力，改善患者临床症状，其效果优于麝香保心丸。

通心方；冠心病；内皮祖细胞

冠心病(CHD)是指由于冠状动脉粥样硬化，导致血管发生狭窄或阻塞，从而致使心肌缺氧缺血甚至坏死而发生一系列临床表现的病症。血管内皮损伤是冠心病发生的病理生理基础,被认为是动脉粥样硬化形成的早期环节,损伤的血管内皮周边趋化炎性细胞,造成血管壁硬化及狭窄,进一步造成血管内皮修复障碍。内皮祖细胞(EPCs)作为一种干细胞，在一定的条件下可分化为血管内皮细胞，具有促进缺血组织血管再生和血管内皮化，抑制血栓形成和冠状动脉支架植入后再狭窄的作用[1]，但EPCs移植治疗冠心病的效果却不理想[2]。本课题组早期临床研究证实，通心方能显著改善冠心病患者的侧支循环和射血分数[3]，能改善冠心病严重三支病变患者的心室重构和心室舒张功能[4]，对于广泛弥漫性病变、失去介入和搭桥机会的严重冠心病患者显示出较好临床疗效。本研究进一步观察了通心方对冠心病患者外周血EPCs数量及功能的影响，旨在探讨该方治疗冠心病的可能作用机制。

1 临床资料

1.1一般资料 收集2015年7月—2016年10月就诊于上海市中医医院心内科和急诊科的冠心病患者48例，年龄40～95岁，均经冠状动脉造影确诊(至少1支血管狭窄>50%)，经心内科、心外科诊断不适合进行冠脉支架植入术和冠脉搭桥术，或患者及家属放弃行冠脉支架植入术和冠脉搭桥术。中医辨证为气虚血瘀证，气虚主症为神疲乏力、心悸气短、面色少华，血瘀主症为胸部固定刺痛、舌质紫暗[5-6]。排除年龄40岁以下或95岁以上者；心功能Ⅳ级或肺水肿者；严重肝肾功能不全者；对中药过敏者；伴发恶性疾病、严重炎性疾病、出血性疾病者；恶性心律失常、急性冠脉综合征、不稳定型心绞痛者；妊娠或哺乳期妇女；老年痴呆者。患者及家属愿意合作，且研究经上海市中医医院伦理委员会通过。采用随机分组的方式将入选者随机分成对照组和治疗组，每组24例，2组一般资料比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表1。

表1 2组一般资料比较

1.2治疗方法 2组患者均根据病情给予血小板抑制剂、硝酸酯类、β受体阻滞剂、他汀类药物、血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、钙离子阻滞剂等常规治疗。在常规治疗基础上，治疗组给予通心方治疗，组方：黄芪30 g、川芎12 g、桃仁15 g、地鳖虫12 g、三棱15 g、牡蛎40 g、桂枝12 g、枳壳12 g、夏枯草12 g，每日1剂,由上海市中医医院制剂科制成水煎剂,分2次口服，每次150 mL；对照组给予麝香保心丸(上海和黄药业有限公司，国药准字 Z31020068)口服，每次2粒，每日3次。2组疗程均为3个月。

1.3检测指标及方法

1.3.1EPCs数量 参照文献[7]方法，采用密度梯度离心法从人外周血提取单个核细胞，用体外诱导方式进行培养。具体方法：分别于治疗前后取2组患者外周静脉血8 mL，经抗凝后，加入淋巴细胞分离液，在室温下，以300 g离心30 min。取中层细胞分层液与血浆交界部位混浊的灰白色层获取单个核细胞。将获取的单个核细胞悬液用Hank's 液洗涤2 次，1 500 r/min 在室温下离心5 min，吸取上清，加入含10%胎牛血清、ECGS 100 mg/L的RPMI-1640 培养液。以(2～3)×106个/mL密度重悬单个核细胞于预先准备好的纤维连接蛋白包被的6孔板，每孔2 mL。置于5%CO2、37 ℃孵育箱中培养,每隔3 d更换1次含胎牛血清和ECGS的培养基。培养至第14天收集贴壁EPCs细胞。将收集的EPCs细胞计数后用PBS溶液稀释，调整待检测细胞浓度为106个/mL,分别重悬于A、B两管中。A管为阴性对照管只加100 μL细胞悬液，B管加入100 μL细胞悬液、FITC标记的CD34(20 μL)、PE标记的VEGF-2(20 μL)、PE-CY5标记的CD45(20 μL)。4 ℃避光孵育1 h。孵育结束后所有检测管进行离心(1 000 r/min,10 min)，弃上清，沉淀用400 μL PBS重悬，使用流式细胞仪进行检测。分析每10 000个细胞中以 CD34阳性、VEGF-2阳性、CD45阴性标记细胞的百分比作为EPCs占外周血中有核细胞的百分比。

1.3.2EPCs增殖能力 将培养14 d的细胞经胰蛋白酶消化，制成(1～5)×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板，设3个复孔，设一空白对照孔，置于5%CO2、37 ℃孵育箱。每天取1 板，检测EPCs增殖能力，连续7 d。具体方法：将Cell Counting Kit-8(CCK-8)和无血清必需基本培养基按1:10体积混合，每孔100 μL加入待测孔中，在37 ℃、5%CO2培养箱中孵育1 h，用酶标仪测定450 nm波长吸光度，记录每块板的OD值，绘制生长曲线。

1.3.3临床疗效 根据中医证候积分计算疗效指数[(治疗前积分-治疗后积分)/治疗前积分×100%]，根据疗效指数评定疗效。显效：70%≤疗效指数<90%；有效：30%≤疗效指数<70%；无效：疗效指数<30%。显效+有效为总有效。

2 结 果

2.12组治疗前后EPCs数量比较 2组治疗前EPCs数量比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗3个月后，2组EPCs数量均明显高于治疗前(P均<0.05)，且治疗组的EPCs数量明显高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 2组治疗前后EPCs数量比较%)

注：①与治疗前比较，P<0.05；②与对照组比较，P<0.05。

2.22组治疗前后EPCs增殖能力及生长曲线比较2组治疗前EPCs增殖活力均低下，OD值呈缓慢上升趋势，2组各时间段 OD值比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。对照组EPCs增殖活力OD值从治疗第4天开始明显高于治疗前(P<0.05)；治疗组EPCs增殖活力OD值于治疗第1天开始明显高于治疗前(P<0.05)，从第5天开始出现对数增殖期，且第5—7天明显高于对照组(P均<0.05)。见表3及图1。

表3 2组治疗前后EPCs增殖能力比较

注:①与治疗前比较，P<0.05；②与对照组比较，P<0.05。

图1 2组治疗前后EPCs生长曲线比较

2.32组临床疗效比较 对照组显效3例，有效12例，无效9例，总有效率63%；治疗组显效8例，有效14例，无效2例，总有效率92%。治疗组总有效率明显高于对照组(P<0.05)。

3 讨 论

冠状动脉搭桥术、经皮冠脉球囊扩张术和支架植入术已经成为冠心病和急性心肌梗死的主要治疗手段，但仍有30%的严重冠脉病变如闭塞病变、弥漫病变、三支血管病变、严重钙化、严重血管扭曲等患者不适合冠脉搭桥术和介入治疗，或因各种原因不愿意手术或支架植入。因此重建血管内皮功能、增强EPCs内皮修复功能成为防治心血管损伤性疾病的全球研究热点。

EPCs大量存在于骨髓及脐血中，仅少量释放到外周血。当内皮功能受到损伤时，能刺激骨髓释放大量EPCs到外周血,并能定向迁移到受损血管内皮处，对损伤的血管内皮进行修复[8]，分泌促血管生长因子促进局部缺血灶血管新生。冠心病患者外周血中 EPCs数量减少,EPCs功能低下,提示EPCs修复损伤的血管内皮能力降低[9-10]。另外EPCs的数量与心血管疾病致死风险呈负相关，检测EPCs数量可用于预测心血管事件的发生[11]。然而EPCs移植治疗冠心病的效果却不理想，分析原因可能为受体心肌对治疗不接受，被注射到心脏局部细胞在局部停留短暂，很快被迁移到肺、脾和其他器官，停留于局部的细胞通常死亡，局部存活的细胞不能与原有心肌细胞协调起作用[2]。

近年来,祖国医学通过抑制血管炎症、重建血管内皮功能、促进血管新生等途径(即所谓的药物搭桥)治疗冠心病取得了一定进展[12-14]。传统中医学认为冠心病属于“胸痹心痛病”范畴,其病机复杂多变，概括为寒凝、气滞、血瘀、气虚、痰浊、阴阳俱损，其中气虚血瘀是冠心病最为常见的病机。麝香保心丸即根据该病机所研制，且临床证实其能够促进冠心病患者EPCs的动员过程，机制可能与麝香保心丸改善患者的血管内皮功能，增加NO的合成有关[15]。故本研究选择麝香保心丸作为对照药物。而本课题组在多年临床实践和研究的基础上, 结合冠心病具有“久病入络,久病必瘀,久病伤气”的特点,提出“活血通络、益气通阳”论治冠心病的观点，创制了通心方。方中黄芪、川芎、桂枝益气行血、温通心阳,桃仁、地鳖虫、牡蛎、三棱活血破血，夏枯草软坚散结，枳壳理气宽中，以气行血，加强活血通络之功,诸药合用共奏益气活血通络、温通心阳之功效,标本兼顾。现代药理学研究证实黄芪具有明显正性肌力作用，能保护血管内皮细胞，促进血管内皮细胞的迁移与增生,具有促进侧支循环生成、加速梗死灶愈合的作用[16]。黄芪的主要有效成分黄芪甲苷可增加体外培养的EPCs数量，改善EPCs增殖、迁移、黏附和体外血管生成能力[17]。川芎的主要成分川芎嗪具有提高机体内NO水平和降低ET-1水平，从而保护损伤的血管内皮功能作用，而完整的血管内皮功能可促进EPCs、VEGF、FGF等多种促血管生成因子释放[18]。桃仁、地鳖虫、牡蛎可以调节血脂，改善高胆固醇血症[19-21]。夏枯草具有一定的抗炎及扩张血管,增加冠脉血流的作用[22]。

骨髓中 EPCs表面标记有3种，即CD133、CD34和VEGFR-2,而外周血中EPCs提取培养后分化成熟，CD133表达逐渐减少甚至缺失，但继续表达CD34和VEGFR-2[23]；CD45则是白细胞的表面标记物，在EPCs中基本不表达。因此,本实验以表达CD34和VEGFR-2双阳性并且CD45表达阴性的细胞鉴定为EPCs。结果显示，治疗3个月后，2组EPCs数量均明显升高，且治疗组明显高于对照组；2组治疗前EPCs增殖上升缓慢、无对数上升期，提示EPCs活力低下；对照组EPCs增殖活力OD值从治疗第4天开始明显高于治疗前；治疗组EPCs增殖活力OD值于治疗第1天开始明显高于治疗前，从第5天开始出现对数增殖期，且第5-7天明显高于对照组；治疗组总有效率明显高于对照组。说明通心方可刺激冠心病患者骨髓释放更多的EPCs到外周血，能显著提高外周血EPCs的增殖能力，引导EPCs归巢到缺血心肌区修复损伤血管内皮，改善缺血灶的血管内皮功能，促进释放促血管生成因子，加速建立侧支循环为缺血心肌提供血供，进而改善患者的心功能及临床症状，且效果优于麝香保心丸，值得临床推广使用。

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EffectofTongxinprescriptionontheendothelialprogenitorcellsinperipheralbloodofpatientswithcoronaryheartdisease

LIU Zheng1, FENG Qimao2, DONG Yaorong2, FAN Jun2

(1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203; 2. Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200071)

ObjectiveIt is to investigate the curative effect of Tongxin Prescription on the number and function of endothelial progenitor cells in peripheral blood of patients with coronary heart disease.MethodsForty-eight patients with coronary heart disease were randomly divided into control group and treatment group, each group had 24 cases. The control group was treated with normal western medicine combined with Shexiang Baoxin Pill, while the treatment group was treated with normal western medicine combined with Tongxin prescription. Both groups were treated for 3 months. The clinical efficacy was evaluated,the changes of the number and function of endothelial progenitor cells in peripheral blood were observed before and after treatment in the two groups.ResultsAfter three months of treatment, the number of endothelial progenitor cells in the two groups was higher than that before treatment, the number of endothelial progenitor cells in the treatment group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). The OD of proliferation ability of endothelial progenitor cells from the fourth day was significantly higher than that before treatment in the control group (P<0.05), and the OD from the first day was significantly higher than that before treatment in the treatment group (P<0.05), furthermore,logarithm phase occurred from the fifth day, and the OD was higher in the treatment group than that in the control group from fifth to seventh day (P<0.05). The total effective rate in the treatment group was obviously higher than that in the control group (P<0.05).ConclusionTongxin Prescription can stimulate the bone marrow to release more endothelial progenitor cells to the periphery, significantly enhance the proliferation ability of peripheral blood cells and improve the clinical symptoms in the patients with coronary heart disease, its effect is better than that of Shexiang Baoxin pill.

Tongxin Prescription; coronary heart disease; endothelial progenitor cells

10.3969/j.issn.1008-8849.2018.01.002

R541.4

A

1008-8849(2018)01-0005-05

刘征，女，博士研究生在读，研究方向为心血管内科疾病诊治。

冯其茂，E-mail：fenqimao@126.com

上海市自然科学基金项目(13ZR1439900)；中国博士后科学基金面上项目(2014M550131)

2017-02-15