谭雄斯,庞武耀
(肇庆医学高等专科学校,广东 肇庆 526020)
·中药工业·
HPLC波长切换法同时测定金嗓散结胶囊中的(R,S)-告依春、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A△
谭雄斯*,庞武耀
(肇庆医学高等专科学校,广东 肇庆 526020)
目的建立金嗓散结胶囊中(R,S)-告依春、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的同时测定方法。方法采用HPLC法,应用Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱;以甲醇-乙腈(3∶1)与0.4%磷酸溶液为流动相,进行梯度洗脱;流速为1.0 mL·min-1;供试品采用50%甲醇超声提取。结果(R,S)告依春、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的线性范围分别为4.150~83.00、5.120~102.4、11.07~221.4、4.590~91.80、8.140~162.8 μg·mL-1,相关系数分别为0.999 2、0.999 9、0.999 4、0.999 7、0.999 5;5种成分分离良好,阴性对测定无干扰,平均加样回收率及相应的RSD分别为99.06%(1.27%)、99.54%(1.15%)、98.19%(0.89%)、97.88%(1.71%)、97.22%(0.99%)。结论所建立的方法可用于金嗓散结胶囊的质量控制。
金嗓散结胶囊;(R,S)-告依春;羟基红花黄色素A;丹酚酸B;木蝴蝶苷B;木蝴蝶苷A;波长切换法;中成药多组分测定
金嗓散结胶囊质量标准收载于《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第十二册,临床上主要用于热毒蓄结、气滞血瘀而形成的慢喉喑及由此而引起的声音嘶哑等症状的治疗,该制剂是由板蓝根、红花、丹参、木蝴蝶等十余味中药材加工而成的胶囊剂,其标准中未对任何成分进行定量测定[1],文献报道也未检索到对该制剂中多组分进行含量的同时测定,为更好地确保临床用药安全及该制剂的质量,本文建立了一种较为简便的HPLC波长切换法,对金嗓散结胶囊中的4味中药材中的5个成分[板蓝根[2]中的(R,S)-告依春、红花[2]中的羟基红花黄色素A、丹参[2]中的丹酚酸B及木蝴蝶中的木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A]同时进行了含量测定,为提高该制剂的质量标准提供参考。
Agilent 1100系列四元梯度泵高效液相色谱仪;METTLER十万分之一电子天平(瑞士);KQ-250B超声波发生器(昆山市超声波仪器有限公司);甲醇、乙腈为色谱纯;磷酸为分析纯;对照品(R,S)-告依春(111753-201505)、羟基红花黄色素A(111637-201609)、丹酚酸B(111562-201615)和木蝴蝶苷B(111915-201202)(中国食品药品检定研究院);对照品木蝴蝶苷A(31567-75-6)(上海同田生物技术股份有限公司)。
金嗓散结胶囊来源于西安碑林药业股份有限公司,规格:每粒装0.4 g,批号见表7。
取对照品(R,S)-告依春、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A各适量,精密称定,分别用50%甲醇溶解并稀释制成一定浓度的单一成分对照品储备溶液[(R,S)-告依春0.415 mg·mL-1、羟基红花黄色素A 0.512 mg·mL-1、丹酚酸B 1.107 mg·mL-1、木蝴蝶苷B 0.459 mg·mL-1和木蝴蝶苷A 0.814 mg·mL-1],再分别精密吸取各对照品储备溶液适量置同一量瓶中,用50%甲醇制成含(R,S)-告依春、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A分别为8.3、25.6、110.7、45.9、40.7 μg·mL-1的混合对照品溶液。
取金嗓散结胶囊适量,倾出内容物,研成细粉,取约0.5 g,精密称定,精密加入50%甲醇50 mL,称定重量,采用KQ-250B超声波发生器超声提取30 min,放冷,用50%甲醇补足减失重量,振摇均匀,过滤,作为金嗓散结胶囊供试品溶液。
按金嗓散结胶囊质量标准项下的处方工艺,制备缺板蓝根、红花、丹参和木蝴蝶的阴性样品,再按照上述方法制备阴性样品溶液。
使用Agilent HC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A:甲醇-乙腈(3∶1),流动相B:0.4%磷酸溶液,梯度洗脱[3-7](0~14 min,20.0%A;14~25 min,20.0%A→42.0%A;25~30 min,42.0%A→60.0%A;30~35 min,60.0%A→20.0%A);0~14 min时在245 nm[8]波长下检测(R,S)-告依春,14~20 min在403 nm[9]波长下检测羟基红花黄色素A,20~35 min在280 nm[10-12]波长下检测丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A。流速:1.0 mL·min-1;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。
精密吸取上述制备的3种溶液各适量,按照2.4项下色谱条件检测,检测结果显示,阴性样品溶液的色谱图中,在混合对照品溶液和供试品溶液所显示的(R,S)-告依春、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A对应的位置无干扰,且分离度符合要求,理论塔板数均大于2500。见图1。
注:A.样品;B.对照品;C.阴性;1.(R,S)-告依春;2.羟基红花黄色素A;3.丹酚酸B;4.木蝴蝶苷B;5.木蝴蝶苷A。图1 样品、对照品、阴性样品HPLC图
取(R,S)-告依春、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A 5个对照品储备溶液,分别精密吸取0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL,置于10 mL量瓶中,50%甲醇稀释,制成6个不同质量浓度的混合对照品溶液,依法进样测定,记录峰面积,得线性回归方程,见表1。
表1 线性关系试验结果(n=6)
取2.1项下制备的混合对照品溶液,连续进样6次,记录峰面积,结果(R,S)-告依春、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A峰面积的RSD分别为1.17%、1.05%、0.61%、0.73%和0.85%(n=6)。
取金嗓散结胶囊(批号:201510023)同一份供试品溶液,于室温下分别在0、2、4、6、8、12 h进样测定(R,S)-告依春、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的峰面积,结果所测5个成分峰面积的RSD分别为1.08%、0.76%、0.57%、0.69%和0.92%,供试品溶液中5个成分在室温条件下12 h内很稳定。
取金嗓散结胶囊样品(批号:201510023)6份,按2.2的方法制备供试品溶液,依法测定,分别计算(R,S)-告依春、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的含量,结果所测5个组分含量的RSD依次为1.42%、0.97%、1.03%、0.56%和1.24%。
取已知含量的金嗓散结胶囊(批号:201510023)适量,倾出内容物,研成细粉,取6份,每份约0.25 g,精密称定,精密加入质量浓度分别为(R,S)-告依春0.228 mg·mL-1、羟基红花黄色素A 0.702 mg·mL-1、丹酚酸B 0.459 mg·mL-1、木蝴蝶苷B 0.671 mg·mL-1和木蝴蝶苷A 0.882 mg·mL-1的单一成分对照品溶液1.0、1.0、5.0、2.0、1.0 mL,按2.2项下方法制备加样回收样品溶液,依法测定,计算所测5个组分的回收率及RSD,结果见表2~6。
表2 (R,S)-告依春加样回收率试验(n=6)
表3 羟基红花黄色素A加样回收率试验(n=6)
表4 丹酚酸B加样回收率试验(n=6)
表5 木蝴蝶苷B加样回收率试验(n=6)
表6 木蝴蝶苷A加样回收率试验(n=6)
取3批金嗓散结胶囊,按2.2的方法制备金嗓散结胶囊供试品溶液,在2.4色谱条件下进样,测定(R,S)-告依春、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A的含量,结果见表7。
表7 含量测定结果(n=3) mg·g-1
金嗓散结胶囊为中药复方制剂,板蓝根、红花、丹参、木蝴蝶为方中的主要药物,板蓝根为十字花科植物菘蓝的干燥根,具有清热解毒、凉血利咽的功能,其主要有效成分为(R,S)-告依春;红花具有散瘀止痛、活血通经的功能,其主要药效成分为羟基红花黄色素A;丹参具有活血祛瘀、凉血消痈的功能,丹酚酸B为丹参的主要成分之一;木蝴蝶为紫葳科植物木蝴蝶的干燥成熟种子,具有清肺利咽的功能,主要用于肺热咳嗽、喉痹、音哑等病症的治疗,其主要成分为木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A。本文采用高效液相波长切换联合梯度洗脱法,同时对金嗓散结胶囊中的主要成分(R,S)-告依春、羟基红花黄色素A、丹酚酸B、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A进行同时测定,为确保产品质量稳定性和疗效一致性提供数据支持。
本文作者在流动相的选择上,首先参考2015年版《中华人民共和国药典》板蓝根药材项下(R,S)-告依春的流动相(甲醇-0.02%磷酸溶液)和木蝴蝶药材项下木蝴蝶苷B的流动相(甲醇-0.2%磷酸溶液),选取甲醇-0.2%磷酸溶液为流动相,不同比例梯度洗脱,结果所测成分(R,S)-告依春、木蝴蝶苷B和木蝴蝶苷A能达到有效分离,但羟基红花黄色素A达不到有效分离,丹酚酸B拖尾现象严重;同时又参考丹参药材项下丹酚酸B的检测流动相(乙腈-0.1%磷酸溶液)和参考文献[9]中羟基红花黄色素A的检测流动相(乙腈-0.4%磷酸溶液),选取乙腈-0.4%磷酸溶液为流动相不同比例梯度洗脱,结果所测成分(R,S)-告依春峰形较差;在此基础上作者经过不断对比实验,以基线平稳情况、分离度、拖尾因子、噪声干扰等各种因素为指标,最终选取甲醇-乙腈(3∶1)与0.4%磷酸溶液为流动相,按照文中的梯度洗脱程序对所测5个成分进行同时测定。
高效液相波长转换联合梯度洗脱法同时测定金嗓散结胶囊中5种主要成分,操作简便,通过系统适用性与专属性试验、线性关系考察等一系列的方法学验证,该方法可以作为金嗓散结胶囊的质量控制标准。
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SimultaneousDeterminationof(R,S)-goitrin,HydroxysafflorYellowA,SalvianolicacidB,Baicalein-7-O-diglucosideandBaicalin-7-glucosideinJinsangSanjieJiaonangbyHPLCWavelengthSwitchingMethod
TANXiongsi*,PANGWuyao
(ZhaoqingMedicalCollege,GuangdongZhaoqing526020,China)
Objective:To develop a method for simultaneous determination of the content of (R,S)-goitrin,hydroxysafflor yellow A,salvianolic acid B,baicalein-7-O-diglucoside and baicalin-7-glucoside in Jinsang Sanjie Jiaonang.MethodsAn HPLC method was adopted for the analysis,which was performed on a Agilent HC-C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)chromatographic column with the mobile phase of methanol-acetonitrile(3∶1)(A)-0.4%phosphoric acid solution(B)in a gradient elution,the flow rate of 1.0 mL·min-1,and the samples were preprocessed with ultrasonic extraction in 50% methanol solution.ResultsThe linearity ranges of(R,S)-goitrin,hydroxysafflor yellow A,salvianolic acid B,baicalein-7-O-diglucoside and baicalin-7-glucoside were 4.150-83.00 μg·mL-1(r=0.999 2),5.120-102.4 μg·mL-1(r=0.999 9),11.07-221.4 μg·mL-1(r=0.999 4),4.590-91.80 μg·mL-1(r=0.999 7),8.140-162.8 μg·mL-1(r=0.999 5),respectively.The five components were separated perfectly without disturbing peaks from negative samples.The average recoveries and the corresponding RSD were 99.06%(1.27%),99.54%(1.15%),98.19%(0.89%),97.88%(1.71%),97.22%(0.99%),respectively.ConclusionThe method can be applied to the quality control of Jinsang Sanjie Jiaonang.
Jinsang Sanjie Jiaonang;(R,S)-goitrin;hydroxysafflor yellow A;salvianolic acid B;baicalein-7-O-diglucoside;baicalin-7-glucoside;wavelength switching method;multicomponent determination of Chinese patent drug
10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.021
肇庆市科技创新指导类项目[肇科(2017)33号文]
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谭雄斯,药师,研究方向:药物分析、质量标准研究等;E-mail:tanxiongsizhaoqing@163.com
2016-12-13)