苯酚-硫酸法联合DNS法测定商陆多糖及响应面法优化超声波辅助提取研究△

杨俊杰，严进，陆兔林

(1.信阳农林学院 信阳市中药资源开发工程技术研究中心，信阳市中药分析检测重点实验室，河南 信阳 464000；2.河南羚锐制药股份有限公司，河南 信阳 464000；3.南京中医药大学，江苏 南京 210023)

·中药工业·

苯酚-硫酸法联合DNS法测定商陆多糖及响应面法优化超声波辅助提取研究△

杨俊杰1*，严进2，陆兔林3

(1.信阳农林学院 信阳市中药资源开发工程技术研究中心，信阳市中药分析检测重点实验室，河南 信阳 464000；2.河南羚锐制药股份有限公司，河南 信阳 464000；3.南京中医药大学，江苏 南京 210023)

目的探寻一种商陆多糖快速、简捷的测定方法。方法利用紫外分光光度计，分别采用苯酚-硫酸法测定商陆总糖含量，DNS法测定还原糖含量，用二者的差值作为测得的商陆多糖含量，并从重复性、稳定性、加样回收率等方面进行方法学考察；通过对商陆多糖超声波辅助提取的单因素研究，以多糖提取率为响应值，采用四因素三水平的响应面试验设计进行工艺优化。结果苯酚-硫酸法联合DNS法测定商陆多糖具有良好的适用性；最佳提取工艺为料液比1∶40(g∶mL)、超声时间30 min、超声温度60 ℃、超声功率350 W，在此这条件下得到商陆多糖提取率平均为(12.38%±0.59%)。结论本实验采用的样品处理方法简单，测定方法可靠，可用于商陆多糖的测定。

商陆多糖；二硝基水杨酸法；苯酚-浓硫酸法；响应面试验设计；超声波辅助提取

商陆系商陆科植物商陆PhytolaccaacinosaRoxb或垂序商陆PhytolaccaamerrcanaL.的干燥根[1]。具有逐水消肿、通利二便、解毒散结等功能，多用于治疗水肿、咳嗽等疾病。其主要有效成分为商陆皂苷、多糖等。现代研究表明，商陆多糖具有抗肿瘤、促进脾淋巴细胞增殖、增强免疫力等作用[2-6]。但现行《中华人民共和国药典》[1]中并未对商陆中商陆多糖含量做质量要求。故在商陆产地加工炮制研究中关于商陆多糖变化的研究不多。目前关于商陆多糖测定方法的记载最早见于王莉等[7]采用水提醇沉法提取商陆多糖，用酚-硫酸比色法测定多糖含量。鲁建江等[8]运用微波技术，用水提醇沉法制得商陆粗多糖，并采用酚-硫酸比色法对其多糖含量进行测定。段静等[9]沿用了王莉等人的水提醇沉方法提取商陆多糖，采用蒽酮-硫酸法测定含量。上述方法中的水提醇沉法前期采用不同有机溶剂，反复回流除杂后热水回流提取，操作繁杂、耗时长。而微波提取技术尚不成熟。超声波辅助提取目前已经广泛用于多糖的提取和测定[11-13]。蒽酮-硫酸法、酚-硫酸法只能测定总糖的含量，需要前期对多糖进行提纯和除杂，除了多糖会受到损失外，同时还存在单糖的干扰。张志君等[14]采用联合3，5-二硝基水杨酸法(DNS)和苯酚-浓硫酸法，通过紫外分光光度法分别测定黄精原药材中还原糖和总糖的含量，取两者之差即为药材中多糖的含量，效果良好。毛淑敏等[15]采用上述方法成功测定了金银花不同花期多糖的含量。本研究尝试采用苯酚-硫酸法联合DNS法测定商陆多糖含量，采用响应面法对超声波辅助提取商陆多糖的提取功率、温度、液料比、提取时间进行优化，从而拟建立一种操作简便，测定准确的商陆多糖测定方法。

1 材料

UV1801型紫外-可见分光光度计(北京普析通用有限公司)；DHG-9240A型电热风干燥箱(上海索谱有限公司)；分析天平(瑞士梅特勒公司)。

商陆样品于2016年10月份在信阳市平桥区采挖，经信阳农林学院周巍副教授鉴定为商陆科植物垂序商陆PhytolaccaamerrcanaL.的新鲜根茎。

葡萄糖对照品(中国计量科学院，批号：GBW10062)；所有试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品处理

商陆采挖后，洗净，除去芦头和须根，切成2 mm厚片，粉碎成粗颗粒后，备用。

2.2 多糖含量测定

2.2.1 葡萄糖对照溶液的配制 精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖，用蒸馏水溶解，配制质量浓度为1.007 g·L-1的葡萄糖对照溶液。

2.2.2 苯酚溶液的配制 精密称取5 g苯酚，用蒸馏水溶解并定容于100 mL量瓶中。

2.2.3 DNS溶液的配制 称取0.65 g DNS用适量蒸馏水溶解，转移至100 mL棕色量瓶中，依次加入32.5 mL的2 mol·L-1的NaOH溶液和4.5 g丙三醇，定容。

2.2.4 标准曲线的制作 分别精密吸取葡萄糖对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.6、2.0 mL，加入蒸馏水至4 mL，再分别精确加入5 mL的DNS溶液，混匀后置沸水浴中煮沸5 min，冷却至室温，定容至10 mL，以空白管为对照，在540 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度(g·L-1)为横坐标，绘制标准曲线Y=0.530 1X-0.051 3(r=0.994)，在0.02～0.2 g·L-1线性关系良好，用于DNS法测定还原糖。

精密量取葡萄糖对照品溶液1 mL，用蒸馏水定容至10 mL，精密量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.7、1.0 mL于10 mL量瓶中，用蒸馏水补足1 mL，再分别精密加1.6 mL的5%苯酚溶液和7 mL的浓硫酸溶液，摇匀，水浴加热20 min，冷却至室温，以空白管为对照，在490 nm测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度(g·L-1)为横坐标，绘制标准曲线Y=7.144 1X+0.02 1(r=0.999 2)，在0.001～0.01 g·L-1呈线性关系，用于测定总糖。

2.2.5 供试品溶液的制备与测定 精密称取商陆粉末2 g，加入10 mL石油醚(60～90 ℃)，热回流脱脂30 min，过滤，挥去残留石油醚，加入蒸馏水100 mL，热回流提取2 h，取上清液，过滤，精密吸取1 mL作为DNS法测定用的原糖供试品溶液。另取上清液1 mL，加入蒸馏水定容至10 mL，精密吸取1 mL作苯酚-硫酸法测定用总糖供试品溶液。

以总糖含量减去还原糖含量即为样品中多糖的含量。

2.2.6 方法学考察 精密度试验：分别精密称取药材粉末6份，按照2.2.5项下的方法制备成供试品溶液，分别测定还原糖和总糖的含量，结果RSD分别1.44%、1.72%，表明精密度良好。

重复性试验：分别精密吸取1 mL还原糖供试品溶液和1 mL总糖供试品溶液各6份，分别测定还原糖和总糖的含量，结果RSD分别1.32%、1.62%，表明重复性良好。

稳定性试验：分别精密吸取1 mL还原糖供试品溶液和1 mL总糖供试品溶液各1份，在0、10、20、30、60、90 min分别测定还原糖和总糖的含量，结果RSD分别为1.64%、1.72%，表明试验在90 min内稳定性良好。

加样回收率试验：分别称取还原糖含量和总糖含量已知的商陆药材粉末2.0 g，共6份，精密称定，精确加入葡萄糖对照品适量，按照2.2.5项下方法测定还原糖和总糖的含量，结果见表1～2。RSD分别1.42%、1.67%。

表1 DNS法测定还原糖加样回收率试验结果(n=6)

表2 苯酚-硫酸法测定总糖加样回收率试验结果(n=6)

2.3 商陆多糖超声波提取工艺优化

2.3.1 单因素试验与结果 称取商陆粉末2 g，至具塞三角瓶中，加入20 mL石油醚(60～90 ℃)，超声提取30 min，弃去石油醚，挥去残留，备用。

2.3.1.1 料液比对多糖提取的影响 经脱脂后的样品按照料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g·mL-1)加入纯化水，设定超声时间为40 min，温度为50 ℃，功率为350 W。过滤，取续滤液按照2.2.5项下方法测定吸光度，分别计算总糖和还原糖的含量。结果见图1。

图1 料液比对多糖提取的影响

由图1可以知，料液比对还原糖测定的影响比较小，对总糖的测定影响大，在料液比较小时，总糖的测出率非常低，料液比在1∶40时，测出率最高，但料液比增大到1∶50后，测出率反而降低。故选择料液比为1∶40。

2.3.1.2 超声时间对多糖提取率的影响 经脱脂后的样品按照料液比1∶40加入纯化水，设定温度为50 ℃，功率为350 W。提取时间分别设定为10、20、30、40、50、60 min。过滤，取续滤液按照2.2.5项下方法测定吸光度，分别计算总糖和还原糖的含量。结果见图2。

图2 提取时间对多糖提取的影响

由图2可知，随着提取时间的增长，还原糖和总糖测出率明显增高，30 min达到一个比较高的水平，随后变化较小，但随着时间进一步地增长，提取率反而有所降低。原因可能是长时间的提取对多糖造成破坏，或者是杂质溶出过多，干扰了测定结果。根据上述情况选择超声提取时间为30 min。

2.3.1.3 超声温度比对多糖提取率的影响 经脱脂后的样品按照料液比1∶40加入纯化水，提取时间30 min，功率为350 W。设定温度分别为40、50、60、70、80 ℃。过滤，取续滤液按照2.2.5项下方法测定吸光度，分别计算总糖和还原糖的含量。结果见图3。

图3 提取温度对多糖提取的影响

由图3可以知，高温可以促使多糖溶出，60 ℃提取率最高，继续升温提取率反而下降。根据上述情况选择超声提取温度为60 ℃。

2.3.1.4 超声功率对多糖提取率的影响 经脱脂后的样品按照料液比1∶40加入纯化水，提取时间30 min，温度为60 ℃。设定功率分别为250、300、400、450、500 W。过滤，取续滤液按照2.2.5项下方法测定吸光度，分别计算总糖和还原糖的含量。结果见图4。

图4 提取功率对多糖提取的影响

由图4可以知，提高功率可以促使多糖溶出，350 W以后提取率变化不大。根据上述情况选择超声提取温度为350 W。

2.3.2 响应面优化工艺设计 在单因素试验基础上，根据Box-Benhnken中心组合设计原理，选择料液比(A)、超声时间(B)、超声温度(C)、超声功率(D)4个因素为影响因子，商陆多糖提取率为影响值，进行四因素三水平响应面试验优化设计，试验因素及设计水平见表3。

表3 Box-Benhnken试验因素及水平(n=6)

2.3.3 响应面优化试验结果分析 按照上述方设计进行试验，结果见表4。

表4 试验结果(n=6)

2.3.3.1 回归模型的建立 用Design Expert8.06软件对表4结果进行二次多元回归拟合，得到回归模型为R1=12.35+0.89A+0.55B-0.13C+0.20D-0.12AB-0.49AC-0.18AD+0.21BC+0.42BD+0.43CD-2.16A2-2.11B2-2.63C2-1.89D2。

2.3.3.2 回归模型的分析 对回归模型进行方差分析，结果见表5。该模型P值<0.01，表明本回归模型极显著，试验设计可行，误差较小。失拟项P值>0.05，差异不显著。经可信度分析，校正决定系数为0.807，信噪比为10.96，远大于4。说明使用该方程进行拟合的效果很好，其他因素对试验结果干扰较小。因此，可以用该方程来确定商陆多糖提取的最佳工艺参数。一次项A影响极显著，B影响显著，二次项影响均为极显著，说明料液比对商陆多糖提取影响最大，其次是提取时间、超声温度和超声功率对试验结果影响不显著。

表5 方差分析

2.3.3.3 回归模型的建立交互作用分析 响应面分析见图5～10。从各响应面可较直观看出各因素交互作用对商陆多糖提取率的影响，曲线越陡，表明该因素对多糖提取率影响越大。就因素的交互作用而言，料液比与提取时间对提取效率影响较大，其他的交互作用差别不大。与方差分析结果相吻合。

2.3.4 响应面优化及验证 由Design Expert 8.06软件得到商陆多糖提取的最佳提取条件为料液比为1∶40.1(g∶mL)，超声时间为30.02 min，超声温度为59.98 ℃，超声功率350 W，在此条件下，商陆多糖提取率为12.35%。为了便于实际操作，将最佳工艺条件修正为料液比1∶40(g∶mL)、超声时间30 min、超声温度60 ℃、超声功率350 W，在此条件下得到商陆多糖提率平均为(12.38%±0.59%)，此条件与预测值十分接近，可说明采用响应面法得到的优化工艺结果是比较可靠，具有一定的实用价值。

图5 料液比与提取温度对多糖提取的交互影响

图6 料液比与提取时间对多糖提取的交互影响

图7 料液比与超声功率对多糖提取的交互影响

图8 提取温度与提取时间对多糖提取的交互影响

图9 提取温度与超声功率对多糖提取的交互影响

图10 提取时间与超声功率对多糖提取的交互影响

3 讨论

本研究建立了酚-硫酸法联合DNS法测定商陆多糖含量方法，可以减少传统方法经过多次提取精制造成的商陆多糖的损失，较为准确地反映出商陆多糖的实际含量，具有一定的应用价值。并用响应面法优化了商陆多糖超声波辅助提取工艺，比传统提取方法简单和快捷，具有良好的应用前景。由于商陆中含有皂苷，可能会对酚-硫酸法和DNS法的测量结果产生影响，初步推断认为两种测定方法相减，可以抵消这种影响，但推断是否正确，尚待进一步研究。本研究采用的超声波提取器，由于容积有限、功率较小，所得的优化条件在其他超声波设备上是否成立，需要进一步验证。

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StudyonDeterminationofPolysaccharidesinRadixPhytolaccaebyPhenol-SulfuricAcidMethodCombinedwithDNSMethodandOptimizationofUltrasonicAssistedExtractionbyResponseSurfaceMethodology

YANGJunjie1*，YANjin2，LUTulin3

(1.XinyangEngineeringResearchCenterfortheexploitationofChineseMedicineResources，XinyangKeyLaboratoryofDetectionandanalysisofChineseMedicine，XinyangAgricultureandForestryUniversity，Xinyang464000，China；2.HenanLingruiPharmaceuticalCo.，Ltd.，Xinyang464000，China；3.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：To find a quick and simple method for determination of polysaccharides in Radix Phytolaccae.MethodsUV spectrophotometry was used to determine the total sugar content by phenol-sulfuric acid method，DNS method was used to determine the content of reducing sugar，and the difference between the two methods was used to measure the content of polysaccharide，and the methods of repeatability，stability and recovery rate were investigated.Based on the single factor study of ultrasonic assisted extraction of polysaccharides from Radix Phytolaccae，the response rate of polysaccharide was taken as the response value，and the response surface experiment design with four factors and three levels was used to optimize the process.ResultsThe phenol-sulfuric acid combined with DNS method for determination of polysaccharides in Radix Phytolaccae showed a good applicability.The optimized extraction process was as follows：solid-liquid ratio 1∶40(g∶mL)，ultrasonic time 30 min，ultrasonic temperature 60 ℃，ultrasonic power 350 W.Under these conditions，the average extraction rate of polysaccharides was 12.38%±0.59%.ConclusionThe method is simple and reliable，and can be used for the determination of polysaccharides in Radix Phytolaccae.

Polysaccharides in Radix Phytolaccae；DNS method；phenol-sulfuric method；response surface methodology；ultrasonic assisted extraction

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.018

国家中医药行业专项(2015468002-2)；信阳市科技攻关项目(150089)

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杨俊杰，副教授，研究方向：中药材产地加工及活性成份开发；E-mail：nanyangjj@163.com

2017-03-30)