茶树组织培养研究进展

郝姗

摘 要 与其他植物相比，茶树的组织培养起步较迟，但在当今组织培养迅速发展的阶段，其发展速度较快。因为可重复性差、外植体褐化、完整植株获得困难等情况的存在，茶树组织培养至今仍未建立完善的高频再生体系。基于此，总结了茶树组培过程中，前人对外植体、培养条件选择的研究结果，并从次生代谢产物生产、种植资源保存和良种繁育推广、加强基础研究、与新的育种方法相结合四个方面对茶树组织培养的研究工作提出展望。

关键词 茶树；组织培养；外植体

中图分类号：S571.1 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.33.068

1 茶树组织培养的意义

农业现代化是当前农业工作的重中之重。茶树是我国传统的特色经济作物，近年来随着产业的不断发展，对优良茶树新品种的需求越来越迫切。传统育种方法已培育出了一些产量高和品质优的品种，但生产上仍缺乏一些符合特定人群消费需求的优良品种，这主要是因为茶树基因具有高度的杂合性，传统的育种方法在改良茶树品种方面难度较大。为更好地为茶农创造较好经济效益，提升茶树育种科技含量，将植物生物技术与茶常规育种技术相结合非常必要。生物技术在育种中的需要建立高频率的遗传转化体系，高频率的遗传转化体系则依赖于高频率再生体系。茶树组织培养快繁技术能够在短时间内用较少的植物材料进行快速培育，生产出较多植株。茶树组织培养具有生产周期短、繁殖系数高、易继承亲本的优良性状等特点。在茶树实际生产中，对于优良无性系品种快速繁殖体系的建立，加快茶新优品种的推广种植具有重大的实践意义。

组织培养由于具有繁殖迅速、去除病毒等优点而在茶树繁殖上得以利用。但茶树组培过程中的一些问题，如愈伤组织易褐化、难以分化、基因不能按序表达等制约了茶树组织培养的进程。目前，要获得经过多次继代培养的完整植株，同时保证植株在大田中存活仍有较大的难度，使组织培养在茶树无性快繁、保存种质资源、建立外源基因转化的受体系统等育种中的应用还有较大距离。

2 茶树组织培养研究进展

2.1 外植体选择

20世纪60年代末，英国剑桥大学首次进行了茶树茎培养，用以研究咖啡碱的合成途径[1]。日本的胜尾清等在同一时期开展茶树花药培养试验[2]。20世纪70年代以来，我国茶树组织培养开始得到广泛研究[1]。通过子叶柄和茶籽下胚轴的培养，直接分化出芽，得到了植株。廖利民[3]等通过叶柄的培养获得了愈伤组织。严学成[4]等通过茶树叶片培养的器官发生途径得到了正常的互生叶小植株，并称有效克服了组织培养中的褐化现象。黄亚辉[5]也通过茶树茎尖培养得到了愈伤组织。

不同外植体的离体反应能力有很大差异，愈伤组织启动时间均不相同。叶片愈伤组织诱导率高于嫩茎，嫩茎诱导率又明显高于根尖[6]。外植体的大小和起始培养物的幼嫩程度也影响愈伤组织产生和器官发生能力，一般幼嫩组织比老叶老茎更易诱导出愈伤组织[7]，不同茶树品种的差异也会对芽的诱导和增殖有影响[8]。

目前，茶树已经从茎尖、腋芽、茎段、叶片、子叶、下胚轴、胚和花药等成熟或未成熟组织中通过愈伤组织或直接产生不定芽的方式成功地进行器官发生和植株再生[9]，但是以营养器官为外植体的成功报道依然较少。

2.2 培养条件选择

由于茶树组培中选择外植体种类的不同，所选择的培养基和培养条件也会有所差异。一般认为，茶树的组培使用MS培养基或1/2MS培养基较好，而温度通常控制在（25±2）℃，光照为1 500～2 000 lx，光照时间为12～16 h，培养基pH为5.0～6.0。

岳川[10]等通过用茶树的腋芽进行芽的诱导分化实验认为，CH的加入可明显促进芽的诱导，但细胞分裂素KT对促进芽分化效果不如BA，在增殖阶段用无生长素的培养基都可得到较好的增殖倍数。王云[11]认为，叶片、茎段都能产生愈伤组织，但茎段的愈伤组织诱导率较高，叶片的愈伤组织诱导率较低。王毅军等[12]以茶树叶片为外植体，以MS培养基附加4 mg/L 6-BA、2 mg/L IAA、

3 mg/L GA以及0.2%～0.3%活性炭诱导出了愈伤组织和胚状体并形成小植株。张建华[2]以茶树新梢腋芽、茎段为试验材料发现，外植体在培养基MS+BA4+NAA0.1中可誘导出愈伤组织并能分化出芽，但在继代培养中以培养基ER+BA3+NAA0.1表现较好。彭正云[13]等对根为材料的研究中则认为愈伤组织如不及时转置新培养基上培养，以后生长十分缓慢，甚至停止生长。而将愈伤组织轮换交叉置于不同培养基上继代培养，其生长比同一组分培养基培养的旺盛。周健[14]等认为，茶树幼胚的萌发需要有一定量的生长素的刺激作用，但较强烈的细胞分裂素的作用对茶树幼胚的萌发有抑制作用。张广辉[15]等认为，若要进行农杆菌介导，共培养基使用添加100 mmol/LAS的YMB培养基好于MS或MSOH培养基，可能是由于MS和MSOH培养基的高盐浓度和低有机物质含量对农杆菌的生长和侵染有抑制作用。

刘德华[16]等以茶树全胚、具有子叶柄的子叶为材料，研究500 lx、1 500 lx、黑暗3种光照条件对植株再生的影响。结果表明，子叶片隆起发生率随光照度增加而降低；子叶柄的胚状体、不定芽分化率随光照度下降而下降；连续在黑暗下培养，子叶片的畸形胚发生率高，且数量多。在相同光照度下培养，全胚的总分化率低于子叶。N.V.Zagoskina[17]等的研究表明，UV-B（280～320nm）对于茶树多酚类物质的累积有强烈的促进作用。同时研究中指出，该作用可能与愈伤组织光合细胞中的PSⅡ系统有关[18]。同时杨娟[19]等研究了LED光源不同光质在植物组培方面的研究，并展望其在茶树组培研究上的应用。

3 目前存在的问题

3.1 可重复性差endprint

由于茶树的组培成功率与外植体来源的苗龄和部位关系密切，导致其可重复性差。一般来说，外植体取材类型、部位、季节、时间、叶位、是否留叶等因素的良好组合，将使外植体有优良的萌发潜力和生长表现。陈志辉[20]等在外植体性质对茶腋芽组培快繁的影响试验中发现，不同品种对培养基组分适应性有较大差异。除品种因素外，外植体所处生长发育的生理状态也有重要的作用。

3.2 外植体褐化

由于茶树植株体内多酚类物质含量很高，导致了外植体褐化现象严重，并成为影响茶树组织培养成功率的关键因素。此外，即使选用茶树多酚含量较低的器官如幼根作为外植体，一旦形成愈伤组织又将产生大量多酚，造成愈伤组织发根和出芽困难，甚至褐化死亡。

杨亚萍[21]的實验表明，MS标准铁盐的0.5倍条件下外植体褐化率较低，而且生长表现良好，外植体先用自来水冲洗过夜，再用45 ℃温水浸泡15 min，能有效降低褐化率。邬秀宏[22]认为，在试验中将叶片的面积尽量切小，避免操作过程中外植体受损均能够减少褐化面积。

3.3 完整植株获得困难

研究发现，茶树组织培养过程中愈伤组织的产生，苗和根的分化遵循普遍原则：激动素/生长素比例高时形成苗，比例低时形成根。但是目前完整植株的获得带有一定的随机性。主要是因为诱导苗和根形成的激素浓度范围往往较狭窄，而且不同的茶树品种，不同的外植体所需的激素种类及浓度均不同。张广辉[15]等认为，茶树在诱导发根成功后易再生出芽，因此可以建立完善的发根诱导体系，但目前尚缺乏进一步的报道。

3.4 营养器官组织培养研究有待进一步深入

目前，以茶树生殖器官为外植体组培成功的案例较多，但以茶树营养器官尤其是茎段作为外植体的报道较少。以子叶等作为外植体易诱导出愈伤组织，但子叶体胚遗传背景与母体的差别很大，因此应进一步加强与母体遗传背景一致的营养器官作为外植体的研究。

4 研究展望

4.1 次生代谢产物生产

茶树富含多酚、咖啡碱、茶氨酸等次级代谢产物，组织培养在形成愈伤组织之后这些次级代谢产物开始在体内堆积，因此组织培养对于研究次生代谢产物的合成机制有重要的意义。同时优化茶树次生代谢产物生产的组培条件和分离提纯方法能能够有效降低其生产成本，弥补天然资源的不足。

4.2 种植资源保存和良种繁育推广

目前，我国的很多茶树品种都逐渐被无性系良种所取代，所以可望通过组织培养或细胞培养进行茶树种质资源的保存，特别是不育或败育率很高的品种，这对节约空间、时间及维持我国茶树品种的多样性不可或缺。茶树组织培养技术只需要很少的植物组织就可以获得大量的植株，不受季节、气候的限制，是加快茶树繁殖速度，有利于良种繁育推广的重要手段。

4.3 基础研究进一步加强

目前，茶树组织培养技术虽然发展迅速，但是相对于其他植物的组织培养而言由于起步较迟，基础研究仍然相对薄弱，如环境对于组培过程和内含物质积累的影响研究还有待进一步加强。此外，抑制褐化和激素配比等问题也需要更进一步的研究。

4.4 与新的育种方法相结合

利用植物生物技术与常规的育种技术相结合，互相取长补短、缩短育种时间、提高效率。在茶树育种中，应用单倍体培育、原生质体融合体细胞杂交、胚培养、转基因技术等能够较快地获得稳定的具有某些优良性状品种，培育出新一代的茶树优质品种，才能有更高产量、更好品质的茶产品的收获，但这些育种方式最终都需要组织培养来获得目的植株。因此，加快建立完善茶树组培再生体系并与新型育种方法相结合对于茶树新品种培育具有重要的意义。

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（责任编辑：赵中正）endprint