银翘散抗禽流感病毒体外抑制试验

赵增成+宋敏训+李桂明+冯敏燕+杨世发+黄中利+傅剑+林树乾

摘要：为测定银翘散对禽流感病毒（AIV）的抑制作用，将不同浓度的银翘散煎煮液分别与H9、H5亚型AIV在体外混合作用30 min后，接种SPF鸡胚，测定鸡胚的死亡率及尿囊液中AIV的血凝价，并采用RT-PCR法对1 g/mL试验组鸡胚进行H9N2病毒检测。结果表明，药物浓度在0.2500 g/mL及以上时，H9N2试验组鸡胚存活率为100%，病毒血凝价为零，药物浓度为1 g/mL时，RT-PCR检测无目的条带出现；药物浓度在0.5000 g/mL及以上时，H5N1试验组鸡胚存活率为100%，病毒血凝价为零。因此，银翘散煎煮液在体外对禽流感病毒具有明显的抑制作用。

关键词：银翘散；禽流感病毒；体外抗病毒试验

中图分类号：S853.75文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）12-0107-04

Abstract In order to determine the inhibitory effect of Yinqiao San on avian influenza virus （AIV），its different concentrations of decoction were respectively mixed with H9 and H5 subtype of AIV in vitro for 30 minutes，and then inoculated SPF chick embryos.The mortality of chick embryo and the hemagglutination titer of AIV were determined， and the H9N2 virus in chicken embryo was tested by RT-PCR.The results showed that the embryo survival rate was 100% in the H9N2 test group and the hemagglutination was 0 when the drug concentration was ≥0.2500 g/mL.The aimless bands were detected by RT-PCR when the drug concentration was 1.0000 g/mL.When the drug concentration was ≥0.5 g/mL， the survival rate of H5N1 test group was 100%， and the hemagglutination titer was 0.Therefore，Yinqiao San decoction has obvious inhibitory effect on avian influenza virus in vitro.

Keywords Yinqiao San； AIV；In vitro antiviral test

《温病条辨》为清代著名温病学家吴鞠通的代表著作，书中所载银翘散是辛凉解表剂的经典代表方，具有辛凉透表、清热解毒之功效，被广泛运用于温热疾病的防治[1-4]。长期以来，大量临床实践和文献资料证明，银翘散对于防治急性感染性疾病有其独特功效，对许多传染病，如流行性感冒、麻疹、手足口病、流行性乙型脑炎、流行性腮腺炎、流行性出血热、病毒性肝炎、疟疾、细菌性痢疾、急性支气管炎、肺炎、败血症、艾滋病等，均取得了较好疗效[5-8]。为探讨银翘散对禽流感的防治效果，笔者应用鸡胚接种试验对银翘散体外抗禽流感病毒的抑制作用进行检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 药物 银翘散，购自济南宏济堂药店。

1.1.2 病毒 H9、H5亞型AIV株，由山东省农业科学院家禽研究所禽病研究室提供。

1.1.3 鸡胚 9～11日龄SPF鸡胚，由山东昊泰实验动物繁育有限公司提供。

1.1.4 1%鸡红细胞悬液 采取成年健康SPF公鸡血液，以3.8%枸椽酸钠溶液（1∶4）抗凝，加5倍生理盐水洗涤，2 000 r/min离心5 min，洗涤3次，取沉淀红细胞用生理盐水稀释为1%鸡红细胞悬液。

1.1.5 仪器 孵化器，购自北京海江孵化设备制造有限公司；PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪均购自杭州博日科技有限公司。

1.1.6 试剂 TRIzol、2×One-step Mix、One-step Enzyme Mix、引物、Rnase-free ddH2O、核酸染料、10×DNA loading buffer，均购自生工生物工程（上海）有限公司；氯仿、异丙醇、乙醇等，均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 银翘散煎煮液制备 称取500 g生药置中药煎煮机中，加水浸泡1 h，煮沸后煎煮30 min，倒出药液。再同法煎煮一次。合并药液，浓缩药液至500 mL，使每毫升药液相当于含生药1 g。高压灭菌后，置4℃冰箱保存备用。

1.2.2 银翘散煎煮液稀释 将煎煮液按10 000 r/min离心5 min，吸取上清液，用蒸馏水倍比稀释成1.0000、0.5000、0.2500、0.1250、0.0625 g/mL的溶液。

1.2.3 银翘散煎煮液调pH至中性 用pH计先测定中药液的pH值，再取煎煮液50 mL，用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.0。

1.2.4 鸡胚接种 取10-2稀释的H9亚型AIV液1 mL，分别与不同稀释浓度的中药煎煮液1 mL在离心管中混合，室温下作用30 min，再取混合液0.2 mL尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每组6枚鸡胚。另外，将pH调至7.0的中药液与病毒液作用后接种一组，病毒对照组接种一组，共7组。endprint

同样，取10-4稀释的H5亚型AIV液分别与不同浓度的中药液等量混合作用30 min后，接种SPF鸡胚。

接种后的鸡胚，继续孵化，每天定时照蛋，检查记录各组鸡胚的死亡、存活情况。

1.2.5 鸡胚AIV血凝价测定 各组死亡鸡胚或最后存活鸡胚均冰箱冷藏过夜后，取尿囊液，进行血凝试验[8]。在96孔V型凝集板上用微量移液器每孔加入生理盐水50 μL，再吸取尿囊液50 μL于第1孔中，充分混合后再从第1孔吸50 μL至第2孔，依次作倍比稀释，至第10孔，最后2孔分别作抗原及红细胞对照，再吸取1%红细胞悬液依次加入各孔，每孔50 μL ，至37℃温箱作用20 min，判定血凝（HA）滴度。

1.2.6 H9N2禽流感病毒RT-PCR检测 在接种H9亚型AIV的鸡胚中，选取最高中药浓度1 g/mL，对各鸡胚进行RT-PCR检测。吸取鸡胚尿囊液，分装于2 mL离心管，10 000 r/min离心10 min，取上清液，TRIzol法提取RNA[9]。根据公开发表的H9N2禽流感病毒全基因组序列，设计上、下游引物，其中上游引物P1：5′-TCAATCAACAAACTCCACAGA-3′，下游引物P2：5′-CCACATGAAAAGAATGTTCT-3′，片段大小490 bp。RT-PCR按一步法进行，采用20 μL反应体系：2×One-step Mix，10 μL；One-step Enzyme Mix，1 μL；引物P1（10 μmol/L），0.5 μL；引物P2（10 μmol/L），0.5 μL；模板RNA，3 μL；Rnase-free ddH2O 加至20 μL。反应条件：50℃ 30 min；94℃ 3 min，94℃ 20 s，50℃ 20 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 5 min。RT-PCR产物电泳检测。

2 结果与分析

2.1 银翘散对H9 亚型AIV抑制试验结果

由表1可知，病毒对照组鸡胚72 h全部死亡，尿囊液中病毒HA平均滴度为8.3。银翘散煎煮液浓度为1.0000、0.5000、0.2500 g/mL时，鸡胚96 h后均全部存活，病毒HA平均滴度全部为零，具有明显的抑制H9亚型AIV作用。银翘散煎煮液在浓度为0.1250、0.0625 g/mL时，从鸡胚存活率及HA效价来看，对病毒无抑制作用。银翘散煎煮液调pH至中性后，同样表现出较好的病毒抑制效果。

2.2 银翘散对H5 亚型AIV抑制试验结果

由表2可知，与H5亚型禽流感病毒对照组相比，从鸡胚存活率和HA血凝价来看，银翘散煎煮液在浓度为1.0000、0.5000 g/mL时，均具有明显的抑制H5亚型AIV作用；浓度为0.2500 g/mL时，对病毒具有一定的抑制作用；浓度为0.1250、0.0625 g/mL时，对病毒无抑制作用。银翘散煎煮液调pH至中性后，同样表现出较好的抑制H5亚型AIV作用。

2.3 鸡胚H9亚型禽流感病毒RT-PCR检测结果

RT-PCR检测结果表明，银翘散煎煮液1.0000 g/mL试验组，各鸡胚尿囊液中均没有检测到H9N2亚型AIV特异性条带，而H9N2 AIV对照组所有鸡胚尿囊液中均有特异性目的条带出现，大小约490 bp。检测结果见表3，电泳图见图1。

3 讨论与结论

3.1 通过鸡胚死亡率、尿囊液中病毒血凝价检测结果来看，银翘散煎煮液在浓度0.2500 g/mL及以上时，对H9亚型AIV具有较强的抑制效果；药物浓度在0.5000 g/mL及以上时，对H5亚型AIV具有明显的抑制效果。RT-PCR检测结果表明，当银翘散煎煮液浓度为1.0000 g/mL时，可完全抑制H9亚型AIV。试验表明，银翘散煎煮液在体外对禽流感病毒具有确实的抑制作用。

3.2 在中药体外抗病毒试验中，由于中药液pH值不同，可能会对试验结果造成影响。银翘散煎煮液pH值为5.0左右，呈弱酸性。在体外抗病毒试验中，各试验组虽然表现出较好的抗病毒结果，但也有可能与药液呈酸性抑制了病毒活性有关。为此，笔者将银翘散煎煮液pH调至中性，发现其仍表现出较好的抗AIV效果，这說明银翘散的体外抗AIV作用与pH值无关，而是自身药效的结果。

3.3 按照温病学理论，现代临床上的多种急性感染性疾病都属于温病范畴[10]。银翘散具有疏风散热、清热解毒功能，被广泛运用于温病的治疗，尤其在一些传染性疾病（如流行性感冒等）上取得了较好疗效[11，12]。本研究为银翘散防治禽流感等家禽疫病提供了药理药效学依据，为挖掘这一宝贵医药资源，并进一步研发新兽药口服液奠定了基础。

参 考 文 献：

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