一株高效解磷青霉菌株的筛选与鉴定

刘春菊+王彩霞+张玉芹+杜传印+梁子敬+于金凤

摘要：采用以Ca3（PO4）2作为唯一磷源的无机磷固体培养基对实验室保存的青霉菌株进行解磷作用初筛，并以Ca3（PO4）2作为磷源的液体培养基对初筛菌株的解磷能力进行定量测定分析，然后对筛选出的高效解磷青霉菌株进行形态学和分子生物学鉴定。定量分析结果表明，初筛青霉菌株中QM-10解磷能力最强，随着培养时间增加，液体培养基中可溶性磷含量先增加后降低并趋于稳定，振荡培养96 h后，培养液可溶性磷含量最高，为1 386.93 mg/L；培养过程中pH值先降低后趋于稳定，对应最小pH值为2.09。形态学和分子鉴定结果表明，QM-10为草酸青霉（Penicillium oxalicum）。

关键词：高效解磷青霉菌株；解磷能力；可溶性磷含量；鉴定

中图分类号：S154.38文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）12-0050-04

Abstract Using the medium with Ca3（PO4）2 as the sole phosphorus source to screen the phosphate solubilizing ability isolates of Penicillium strains which were stored in laboratory. In order to obtain the strains with the highest phosphate-solubilizing capacity， the first selected Penicillium strains were individually inoculated into the liquid medium containing Ca3（PO4）2 as the sole phosphorus source to quantitatively analyze their phosphate solubilizing ability. The results showed that the QM-10 strain had the highest ability of phosphorus solution. With the increase of incubation time， the soluble phosphorus content increased firstly， then decreased and finally tended to stabilize. After 96 hours of concussion culture， the soluble phosphorus content in the culture solution of QM-10 was the highest as 1 386.93 mg/L.The pH value of its culture solution first decreased and then tended to be stable，corresponding to the minimum value as 2.29. The morphological and molecular identification confirmed that QM-10 strain belonged to Penicillium oxalicum.

Keywords Phosphate-solubilizing Penicillium strains；Phosphate-solubilizing capability； Soluble phosphorus content； Identification

磷是植物生长发育所必需的矿质元素之一，对促进植物的生长发育和新陈代谢具有重要作用[1]。为提高农作物的产量和品质，农民每年向土壤中施入大量磷肥。但由于土壤矿物质对磷元素具有很强的吸附和固定作用，大部分磷与土壤中的Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+结合形成溶解性较差难以被植物吸收利用的磷酸盐[2]，导致施入磷肥的当季作物利用率仅为5%～25%。因此，如何有效提高磷肥的利用效率，是目前农业生产中亟待解决的问题。

土壤中存在着细菌、真菌和放线菌等多种解磷微生物，它们通过自身的生命活动，将土壤中不溶性磷转变为可溶性磷，一方面供植物生长发育需要，另一方面提高植物对施入土壤的磷肥利用效率。目前，国内外已报道的解磷微生物中，解磷细菌的种类、数量较多，但研究表明真菌的解磷能力比细菌要强几倍或10倍以上[3]。1952年Johnson首次探索了真菌解磷效果，并且报道Aspergillus niger具有较强的解磷能力[4]。目前报道的解磷真菌主要有青霉（Penicillium）、曲霉（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）、鐮孢菌（Fusarium）等，其中研究较多的是黑曲霉（Aspergillus niger）和青霉（Penicillium）[5]。Acevedo报道了两株高效解磷真菌（Aspergillus和Penicillium）的解磷能力分别能达到82%和80%[6]。

本试验使用无机磷培养基对实验室保存的180株青霉菌进行解磷能力初筛，再用无机磷液体培养基对初筛菌株进行培养并测定菌液的可溶性磷含量、pH值，从中选择解磷效果较好青霉菌株，并对这个菌株进行形态学鉴定和分子鉴定，为今后研究和开发相应的微生物菌剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

菌株：实验室保存的180株青霉菌，分离自山东潍坊烟株根际土壤和山东栖霞、蓬莱、昌邑，辽宁大连、金州、秦皇岛，河北沧州等渤海湾果园土壤；其中QM-10分离自山东蓬莱地区的果树根际土壤。

培养基：马铃薯葡萄糖培养基，用于青霉菌株的培养；以Ca3（PO4）2作为唯一磷源的无机磷固体培养基和液体培养基，用于供试菌株解磷能力定性及定量测定[7]。endprint

1.2 试验方法

1.2.1 解磷青霉的初筛 取活化后青霉菌株接种于无机磷固体培养基上， 28℃恒温培养7 d，测定菌落直径（d）、解磷圈直径（D），重复3次。根据解磷圈直径与菌落直径比值（D/d）初步确定各菌株解磷能力[8]。

1.2.2 解磷能力定量测定 按照魏景超[10]研究方法制作磷标准曲线，得出回归方程，计算菌株的解磷量。将初筛具有一定解磷能力的青霉菌株孢子分别刮入无菌水中，于28℃、160 r/min条件下，摇床振荡培养30 min，使孢子充分散开，制备成菌悬液，用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，最终得到浓度为108 cfu/mL的孢子悬浮液。按1%接种量将孢子悬浮液接种于100 mL无机磷液体培养基中，28℃、180 r/min摇床振荡培养，分别在0、24、48、72、96、120、144、168 h取上清液，按照钼锑抗比色法[9]測定可溶性磷含量，采用pH计（赛多利斯pH计，PB-10）测定pH值。

1.2.3 菌株鉴定 形态特征观察测定参照《真菌鉴定手册》[10] 和《中国真菌志（第三十五卷）》 [11]青霉属及其相关属的鉴定方法进行；分子生物学鉴定按照参考文献[12]中的方法进行。

1.3 数据统计分析方法

采用DPS数据处理系统软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 高效解磷青霉菌株的初筛

根据解磷圈直径与菌落直径比值（D/d）的大小，初步筛选到6株具有解磷效果的菌株（详见表1），其中QM-10、QM-6、QM-4-1解磷效果较好，D/d分别为1.47、1.33和1.27。

2.2 高效解磷青霉菌株的复筛

由表2可见，青霉菌株QM-10对Ca3（PO4）2的溶解效果最好，其对应的最大可溶性磷含量为1 386.93 mg/L，此时对应的pH值为2.09。

2.3 高效解磷青霉菌株的解磷能力定量测定

菌株QM-10在液体培养基中振荡培养（图1），随培养时间的延长，培养液中可溶性磷含量先增加后降低并趋于稳定，培养0～24 h时变化不是很明显，培养至24～96 h时可溶性磷含量急剧增加，且在96 h时达到最大值；培养基初始pH为6.9，在培养过程中，pH值均有所降低，后趋于稳定。可见pH值大小与菌株最大可溶磷含量基本呈反比，即可溶性磷含量越高，对应的pH值越小。

2.4 高效解磷青霉菌株的形态学鉴定

菌株QM-10在PDA培养基上菌落平坦，质地绒状，菌落正面墨绿色，反面淡黄色（培养168 h），边缘厚密（图2）。分生孢子易脱落，产生大量分生孢子。随培养时间延长，菌落表面孢子堆积成壳状，有渗出液出现。

显微镜观察结果显示，该菌株具有青霉属典型的帚状枝（图3B），分生孢子梗通常双轮，偶有三轮或单轮，梗基彼此较紧贴；瓶梗每轮5 ～ 8 个或更多；分生孢子形态近圆柱状，梗颈通常明显，壁平滑。这些形态特征与草酸青霉（Penicillium oxalicum）的描述性状相符合。

2.5 高效解磷青霉菌株的分子鉴定

以 ITS1 和 ITS4 为引物，对菌株QM-10的基因组DNA进行PCR扩增，得到500～750 bp左右条带（图4）。将测序结果与GenBank中已提交序列比对、进行同源性分析，利用软件MEGA 5.0，以部分Penicillium sp. 菌株为基础构建5.8S rDNA基因进化树（图5），发现菌株与草酸青霉菌株NJDL-03（KT354504.1）的相似性为 100%。

根据以上分生孢子特征，参照《真菌鉴定手册》[10]和《中国真菌志（第三十五卷）》[11]青霉属及其相关有性属，确定菌株QM-10为草酸青霉（Penicillium oxalicum）。

3 讨论与结论

平板解磷圈法和液体培养法是研究微生物解磷能力最常用的两种方法，本研究利用这两种方法筛选到一株高效解青霉菌株 QM-10，结合菌体形态特征、ITS序列分析等研究方法，最终将菌株QM-10 的分类地位明确为草酸青霉（Penicillium oxalicum）。

关于微生物解磷能力与培养介质pH值之间的关系，有人认为培养基的pH值与解磷量的相关性不明显[13]，也有人认为培养基中pH值与解磷微生物的解磷能力具有很明显的相关性[14，15]，即培养介质的pH值越低，培养液中的可溶性磷量越大，表明培养介质的酸度对溶磷量有很大影响。本研究中，菌株QM-10上清液的 pH值与可溶性磷含量存在一定负相关性，基本是可溶性磷含量越高，对应的pH值越小，与Vassilev等[14]的研究结果相似。

分泌有机酸，使pH 值降低，溶解难溶性磷，增加可溶性磷含量，是微生物解磷的重要机制之一。结合微生物解磷机理分析，可能是在培养过程中菌株QM-10产生有机酸与复合磷酸盐中的钙结合形成稳定的可溶性复合物，进一步溶解土壤中的难溶性磷酸盐。但在培养过程中可溶性磷含量会在某一时刻达到最大值，却不会随着时间的延长而一直增加，可能因为：①培养基中已有的可溶性磷含量会抑制对磷酸钙的进一步溶解；②碳源的消耗会限制有机酸的产生及青霉的活动[16]。

参 考 文 献：

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