‘小白杏’诱导愈伤组织及不定芽体系的优化

谢晓婷+郭明星+许竹叶+代丽娟+郝风顺+冯建荣

摘要：為建立快速繁殖离体培养再生体系并为遗传转化奠定基础，本研究以‘小白杏胚和叶片为材料，探讨了氯化汞和次氯酸钠消毒的方法和时间对种子和种胚的影响，2，4-D（0.5，1.0，1.5 mg/L）、ZT（0.5，1.0，1.5 mg/L）和TDZ（1.0，2.0，3.0 mg/L）浓度配比对‘小白杏胚诱导愈伤组织再分化不定芽的作用，及2，4-D（0.5，1.0 mg/L）、IBA（0.5，1.0 mg/L）、NAA（0.5，1.0 mg/L）浓度配比对‘小白杏叶片诱导愈伤组织再分化不定芽的作用。结果表明：使用10%的次氯酸钠消毒10 min，种胚污染率和死亡率最低，分别为2.6%、0.7%，存活率最高，为96.7%；在3/4MS+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D处理下，胚诱导愈伤组织形成率和不定芽诱导率最高，分别为98%、96%；在3/4MS+2.0 mg/L AgNO3+1.0 mg/L ZT+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L IBA处理下，叶片诱导愈伤组织形成率和不定芽诱导率最高，分别为96%、93%。综合来看，胚诱导愈伤组织再分化形成不定芽的诱导率优于叶片，种子和种胚消毒的最佳方案是10%的次氯酸钠消毒10 min；胚诱导愈伤组织再分化形成不定芽最佳配方是3/4MS+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D；叶片诱导愈伤组织再分化形成不定芽的最佳配方是3/4MS+2.0 mg/L AgNO3+1.0 mg/L ZT+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L IBA。

关键词：杏；胚；叶片；愈伤组织；不定芽

中图分类号：S662.2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）12-0006-05

Abstract To establish rapid propagation and regeneration system for ‘Xiaobaixing in vitro and provide foundations for genetic transformation， with embryo and leaf as explants， we studied the effects of disinfection with mercuric chloride and sodium hypochlorite on seed and embryo， the effects of different concentration ratios of 2，4-D（0.5，1.0，1.5 mg/L），ZT（0.5，1.0，1.5 mg/L）and TDZ （1.0，2.0，3.0 mg/L） on embryo induction， and that of 2，4-D（0.5，1.0 mg/L），IBA（0.5，1.0 mg/L）and NAA（0.5，1.0 mg/L）on leaf induction.The results showed that the pollution rate and mortality were the lowest with 10% sodium hypochlorite disinfecting seed and embryo for 10 minutes， which were 2.6% and 0.7% respectively， and the survival rate was the highest as 96.7%. In the treatment condition of 3/4MS containing with 2.0 mg/L TDZ and 1.0 mg/L 2，4-D， the rate of callus formation and adventitious bud induction with embryo as explant were the highest， which were 98% and 96%， respectively. In the treatment condition of 3/4MS containing with 2.0 mg/L AgNO3， 1.0 mg/L ZT， 2.0 mg/L TDZ and 1.0 mg/L IBA， the rate of callus formation and adventitious bud induction with leaf as explant were the highest， which were 96% and 93% respectively.In conclusion， the callus differentiation to adventitious buds with embryo as explant was better than that with leaf as explant. The best treatment for disinfecting seed and embryo was both with 10% sodium hypochlorite for 10 minutes. The optimal medium for inducing callus redifferentiation to adventitious buds of embryo was 3/4MS containing with 2.0 mg/L TDZ and 1.0 mg/L 2，4-D， while that for leaves was 3/4MS containing with 2.0 mg/L AgNO3，1.0 mg/L ZT，2.0 mg/L TDZ and 1.0 mg/L IBA.

Keywords Apricot；Embryo；Leaves；Callus；Adventitious budendprint

新疆是世界杏的起源中心之一，有著丰富的种质资源[1-3]。‘小白杏产于享有“中国白杏之乡”称号的库车县和轮台县[4]，是当地民间长期连续实生选择获得的地方优良品种，肉质细腻香甜，种子壳薄易碎，但不耐储运，自花结实率低。

核果类果树胚培养始于1933年Tukey[5]对樱桃的胚培养，通过胚可直接诱导产生苗，在桃、杏、枣等果树上均已获得成功[6]。何炎红等[7]以山杏成熟胚为外植体，经愈伤组织诱导丛生芽，建立再生植株，为山杏快速繁殖和种质资源保护等提供参考依据。在以叶片作为外植体的研究中，边俊荣[8]已筛选出山杏叶片愈伤组织诱导的培养基，并发现叶片正面向下接触培养基的再生效果较好。楚宗丽[9]筛选出凯特杏幼胚子叶不定芽诱导的适宜配方，解决了早期胚珠离体培养困难的问题。刘小蕾[10]通过对山杏叶片的组织培养初步建立了山杏再生体系。郭生武[11]成功地从大扁杏叶片诱导出愈伤组织，但未实现从愈伤组织获得完整植株。而关于新疆南疆‘小白杏胚诱导愈伤组织及不定芽和叶片诱导愈伤组织及不定芽方面的研究尚未见报道。本研究分别以‘小白杏胚和叶片为外植体，通过对愈伤组织形成率及不定芽诱导率的比较，筛选适宜外植体，以期为‘小白杏高频率离体培养再生体系的建立和遗传转化研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2015年6月25日，采集新疆农业科学院轮台国家果树资源圃杏品种‘小白杏。将果实去肉，洗净果核，取出杏仁进行试验。

1.2 试验方法

试验于2015年7月—2016年12月在石河子大学农学院果树实验室进行。

1.2.1 种子和种胚消毒 采用本课题组预备试验的方法，用自来水冲洗种子30 min，无菌水冲洗4次，75%的酒精浸泡30 s，再用无菌水冲洗5次，然后用0.1%HgCl2 7 min、10%NaClO 10 min分别对种子消毒，再用无菌水冲洗4次并浸泡24 h后取出种胚，用流水清洗30 min，再以70%酒精浸泡30 s后用无菌蒸馏水清洗2次[8]，再分别用0.1% HgCl2 7 min、0.1% HgCl2 10 min、10%NaClO 7 min、10% NaClO 10 min、20%NaClO 7 min、20% NaClO 10 min进行种胚消毒。具体试验设计见表1。

将处理好的种胚分别接种到1/2MS基本培养基中，每个配方接种30个种胚，重复5次，置于人工气候箱暗培养20 d（25℃），一个月后统计种胚的污染率、死亡率和存活率。种胚污染率=（污染的种胚数/接种的种胚总数）×100%；种胚死亡率=（褐化死亡但未污染的种胚数/接种的种胚总数）×100%；种胚存活率= 100%-种胚污染率-种胚死亡率[8]。

1.2.2 胚诱导愈伤组织再分化形成不定芽 本试验以3/4MS为基础培养基，通过对2，4-D、ZT、TDZ 3种激素进行不同浓度的配比来设计培养配方（表2）。每个配方接种30个种胚，重复5次。置于暗培养箱25℃ 培养20 d后，再进行光培养，温度为25℃，光周期为16 h光照8 h黑暗，光照强度为3 000 lx。每隔7 d观察1次，记录胚恢复生长的时间。在培养20、40 d时统计愈伤组织形成率和不定芽诱导率。愈伤组织形成率=（分化出愈伤组织的外植体数/存活的外植体总数）×100%；不定芽诱导率 =（分化出不定芽的外植体数/存活的外植体总数）×100%[8]。将获得的不定芽转入本课题组筛选出的最优壮苗培养基中进行培养，利用幼苗叶片进行叶片诱导愈伤组织再分化形成不定芽的试验。

1.2.3 叶片诱导愈伤组织再分化形成不定芽 选取进行过壮苗的植株上的叶片，依据前人经验[12]先进行预试验，然后在叶片的正面进行横向划伤，并将正面贴于培养基上。培养基以3/4MS为基本培养基，附加2.0 mg/L AgNO3+1.0 mg/L ZT+2.0 mg/L TDZ，通过添加不同浓度的IBA、NAA、2，4-D设计培养配方（表3）。每个配方接种30个叶片，重复5次。接种后置于暗培养箱（25℃）培养14 d后进行光培养，温度为25℃，光周期为16 h光照和8 h黑暗，光照强度为3 000 lx。分别在培养14、30 d时统计愈伤组织形成率和不定芽诱导率。

1.3 数据处理及分析

通过SPSS 19.0进行差异分析，显著水平为P< 0.05。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法对‘小白杏种胚初代培养的影响

由表4可知，种子用10%NaClO消毒10 min处理的存活率均高于种子用0.1%HgCl2 消毒7 min。

同一种子消毒方法下，用NaClO消毒种胚的存活率高于用HgCl2消毒的，且均以10%NaClO消毒10 min的存活率最高，其次为20%NaClO消毒7 min。

综合考虑，种子和种胚均以10%NaClO消毒10 min的效果最佳，种胚存活率可达96.7%，显著高于其他处理。

2.2 不同配方对胚诱导愈伤组织再分化形成不定芽的影响

将‘小白杏的胚接入培养基7 d后，X3处理的愈伤开始有萌动的迹象（图1A）。在第14 d时X3处理的胚开始长出少量乳白色雪花状的愈伤组织（图1B）。随着培养时间的延长，愈伤组织的生长量不断增加。而未发育出愈伤组织的胚先是体积逐渐膨大，随后开始出现褐化现象，最终变干死亡（图1）。

由表5可知，X3处理的愈伤组织形成率为98%，不定芽诱导率为96%，显著高于其他处理（P< 0.05）。TDZ和2，4-D组合的愈伤组织形成率和不定芽诱导率较高，综上得出，胚诱导愈伤组织再分化形成不定芽的最优配方为3/4MS+2.0 mg/L TDZ+ 1.0 mg/L 2，4-D。endprint

2.3 不同配方对叶片诱导愈伤组织再分化形成不定芽的影响

接种10 d后Y4处理的伤口处最先开始形成乳白色的愈伤，在20 d左右，不定芽开始陆续出现（图2B）。由表6可知，Y4和Y5愈伤分化的时间最短为10d，Y1愈伤分化的时间最长为15d。Y4的愈伤组织形成率为96%，不定芽诱导率为93%，显著高于其他处理（P< 0.05）。2，4-D和IBA处理的愈伤组织形成率和不定芽诱导率均随着其质量浓度的增加而升高，而NAA处理的则随着其质量浓度的增加而降低，表明较高质量浓度的2，4-D和IBA对愈伤形成和不定芽分化具有一定的促进作用，而高质量浓度的NAA则对其具有一定的抑制作用。综上可知，叶片诱导愈伤组织再分化形成不定芽的最优配方为3/4MS+2.0 mg/L AgNO3+1.0 mg/L ZT+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L IBA。

3 讨论

现有的大量关于杏再生体系建立的报道中，研究山杏居多，研究者选用的外植体大都为其子叶[13]、茎段[14]、茎尖[15，16]等，主要探讨了不同外植体及培养基中植物生长调节剂对愈伤组织和不定芽再生的影响[17-21]。山杏胚愈伤组织诱导率最高的配方是0.5 mg/L 2，4- D+1.0 mg/L 6-BA，诱导率为80.37%[8]；山杏叶片的愈伤组织诱导率和不定芽诱导率最高的配方是QL+2.0 mg/L TDZ+0.75 mg/L NAA，其诱导率分别为100%和11.1%[12]。本试验中，对‘小白杏胚诱导愈伤组织采用3/4MS+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D配方的诱导率最高，为98%；叶片愈伤组织采用3/4MS+2.0 mg/L AgNO3+1.0 mg/L ZT+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L IBA的配方诱导率最高，为96%。可见，TDZ与2，4-D组合对‘小白杏胚诱导愈伤组织的效果优于6-BA与2，4-D组合且TDZ浓度对种胚诱导愈伤组织和不定芽影响较大，TDZ浓度为2.0 mg/L 时对愈伤组织和不定芽的诱导效果最好，这可能与TDZ可以促进植物芽的再生和繁殖、打破芽的休眠、促进种子萌发、促进愈伤组织生长等生理活性有关[22]。本试验中尚未进行对根系的诱导研究以获得完整植株，在今后的试验中可进一步完善该环节。

4 结论

4.1 对‘小白杏种子和种胚进行消毒的最佳方案均为10%NaClO消毒10 min，存活率最高，为96.7%。

4.2 ‘小白杏胚诱导愈伤组织再分化形成不定芽的最佳配方为3/4MS+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D，愈伤组织形成率和不定芽诱导率分别为98%、96%。

4.3 ‘小白杏叶片诱导愈伤组织再分化形成不定芽的最佳配方为3/4MS+2.0 mg/L AgNO3+1.0 mg/L ZT+2.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L IBA，愈伤组织形成率和不定芽诱导率分别为96%、93%。

4.4 ‘小白杏胚诱导愈伤组织再分化形成不定芽诱导率优于叶片，因此，‘小白杏的胚比叶片更容易诱导出愈伤组织及不定芽。

参 考 文 献：

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