大恒鸡与金阳丝毛鸡TGFB2基因在不同组织中的表达差异

张增荣，杜华锐，李晴云，杨朝武，邱莫寒，蒋小松*

(1.四川省畜牧科学研究院，成都 610066；2.四川大恒家禽育种有限公司，成都 610066；3.动物遗传育种四川省重点实验室，成都 610066)

大恒鸡与金阳丝毛鸡TGFB2基因在不同组织中的表达差异

张增荣1，2，3，杜华锐1，2，李晴云1，2，杨朝武1，2，邱莫寒1，2，蒋小松1，2，3*

(1.四川省畜牧科学研究院，成都 610066；2.四川大恒家禽育种有限公司，成都 610066；3.动物遗传育种四川省重点实验室，成都 610066)

【目的】探讨TGFB2基因对鸡肌肉生长发育的影响。【方法】利用定量PCR方法对TGFB2基因在鸡不同组织、不同生长发育阶段的表达差异进行了比较研究。【结果】研究结果显示：2周龄大恒鸡腿肌中TGFB2 mRNA表达量显著高于金阳丝毛鸡，并且达到最高值。10周龄金阳丝毛鸡母鸡胸肌组织中TGFB2 mRNA表达量均显著高于大恒鸡，并达到最高值；大恒鸡公鸡10周龄腿肌组织中TGFB2 mRNA表达量均与其他周龄差异显著，并达到最高值。金阳丝毛鸡、大恒鸡母鸡10周龄胸肌组织中TGFB2 mRNA表达量均显著高于2周龄。【结论】TGFB2基因可能是影响鸡肌肉生长发育的候选基因。

鸡；TGFB2基因；定量PCR；组织表达

转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一组蛋白超家族。TGF-β的命名是根据这种细胞因子能使正常的成纤维细胞的表型发生转化，即在表皮生长因子(EGF)同时存在的条件下，改变成纤维细胞巾壁生长特性而获得在琼脂中生长的能力，并失去生长中密度信赖的抑制作用。起初对TGF-β的生物学功能研究主要在炎症、组织修复和胚胎发育等方面，近年来发现TGF-β对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用。转化生长因子-β可以促进成纤维细胞、成骨细胞和雪旺氏细胞的生长。TGF-β1、TGF-β2促进成纤维细胞IL-6的产生，其机理可能是通过对IL-6基因转录的调节，也抑制上皮细胞、破骨细胞、内皮细胞生长和脂肪、心肌、骨骼肌的形成。TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3在大多数生物学作用方面非常相似，但在有些作用方面可有很大差异，如TGF-β2对血管内皮细胞和造血祖细胞的生长抑制作用仅为TGF-β1和TGF-β3 的 1％[1]。

大恒699肉鸡配套系(大恒鸡)来自四川大恒家禽育种有限公司，目前在全国18个省市推广，70日龄商品代肉鸡体重公鸡2.32 kg、母鸡1.79 kg，公母鸡平均耗料增重比2.45。金阳丝毛鸡是一个古老而稀有的地方鸡种，主要产于四川省凉山州金阳县，毗邻的昭觉、雷波、布拖县有零星分布,该鸡种耐粗饲、肉质鲜美、外观独特，作为肉用和药用品种深受消费者喜爱，但由于缺乏系统的保种研究和开发利用，该品种依然存在整齐度差、生产性能不高以及存活率偏低等问题，金阳丝毛鸡7月龄平均体重1.40 kg，成年公鸡平均体重2.23 kg，成年母鸡平均体重1.45 kg。

TGFB2基因作为转化生长因子-β的一种亚基，对肌肉的生长发育有一定的影响。目前，TGFB2基因作为家禽肌肉生长候选基因的相关研究报道不多，而鸡TGFB2基因组织表达差异的研究国内外少见报道。大恒鸡与金阳丝毛鸡生长速度差异大，本研究利用定量PCR方法研究TGFB2基因在这两种鸡不同组织、不同生长发育阶段的表达差异进行比较研究，为筛选能用于鸡肌肉组织的生长和发育标记辅助选择的分子标记提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选取大恒699肉鸡、金阳丝毛鸡两个鸡种，每个鸡种在2周龄、6周龄、10周龄采集15公15母样本。每组通过放血的方法屠宰，屠宰之前禁食12h，屠宰之后迅速采集右侧的胸肌、腿肌和肝脏组织，同时测定屠宰数据。所有采集的样品迅速置于液氮中保存，用于做荧光定量PCR分析。

1.2 各组织总RNA的提取

用Trizol法提取两鸡种各个时期的胸肌、腿肌、下丘脑、垂体中的总RNA。测定RNA浓度和纯度，置-70℃保存。

1.3 引物的设计与合成

鸡TGFB2基因的引物设计参照cDNA序列(GenBank注册号NM_001031045.3序列)，用Oligo6.0软件设计，上游引物序列为5’-CGAAAATGCCATCC CACC-3’，下游引物序列为5’-GCTCTATCCGCTGC TCCGA-3’，扩增产物长度为161 bp。

GAPDH作为内参基因，GAPDH基因引物设计参照cDNA序列(GenBank注册号NM_204305.1序列)，用Oligo6.0软件设计，上游引物序列为5’-CTGCCCAGAACATCATCCCA’，下游引物序列为5’-CGGCAGGTCAGGTCAACAAC-3’，扩增产物长度为139 bp。引物由大连宝生物公司合成。

1.4 实时荧光定量PCR

采用SYBR Green I染料法，优化荧光实时定量PCR 的反应条件，确定反应体系(25μL)：SYBRⓇPremix Ex TaqTM(2×)12.5μL，上游引物(10μmol/L)0.5μL；下游引物(10μmol/L)0.5μL；cDNA 溶液2μL；dH2O 9.5μL。每个样品设置 3 个重复。设定阴性对照。扩增参数同常规PCR。为了分析real-time PCR扩增特异性，在定量扩增参数后增设下列步骤：95℃1min；60℃1min；60℃30s，循环81次。

1.5 统计分析

实时荧光定量PCR是最准确最灵敏的核酸检测技术，根据Bio-Rad CFX Manager软件计算相对定量结果，主要根据如下公式计算：

采用SPSS 19.0进行独立样本t检验、单因素方差分析，数据结果均以“最小二乘均数±标准差”表示。本次统计采用2周龄的表达水平作为对照。

2 试验结果

2.1 常规PCR及测序结果

常规PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示TGFB2基因PCR扩增产物条带清晰，明亮，无杂带，说明产物具有很高的特异性。测序结果与目的序列一致性为100％，为目的基因片断。

2.2 TGFB2基因的组织表达差异

2.2.1 TGFB2基因在大恒鸡各周龄表达量的差异

TGFB2基因在大恒鸡2周龄(14d)、6周龄(42d)、10周龄(70d)的不同组织(胸肌、腿肌、下丘脑、垂体)均存在表达，并且公鸡与母鸡表达的趋势不同。由图1可知，公鸡6周龄胸肌中TGFB2基因表达量极显著高于其余周龄的表达水平(P<0.01)；在腿肌组织中，10周龄的表达量极显著高于2周龄、6周龄的表达水平(P<0.01)；在垂体组织中同样也是10周龄表达高，并达到显著水平(P<0.05)；在下丘脑组织中各周龄表达差异不显著。

由图2可知，母鸡10周龄胸肌组织中TGFB2基因的表达量与2周龄相比达到显著水平(P<0.05)，与6周龄差异不显著；腿肌组织中6周龄的表达量高于2周龄腿肌组织中的表达量，并达到显著水平，与10周龄腿肌组织中的表达量差异不显著；下丘脑组织中6周龄的表达量显著高于10周龄的表达量(P<0.05)；垂体组织中10周龄的表达水平极显著高于6周龄的表达水平(P<0.01)。

图1 TGFB2基因在大恒鸡公鸡不同时期、组织的相对表达量Figure 1 Relative expression of TGFB2 at different tissues and ages of male Daheng chicken

图2 TGFB2基因在大恒鸡母鸡不同时期、组织的相对表达量Figure 2 Relative expression of TGFB2 at different tissues and ages of female Daheng chicken

2.2.2 TGFB2基因在金阳丝毛鸡各周龄表达量的差异

TGFB2基因在金阳丝毛鸡各周龄胸肌、腿肌、下丘脑、垂体组织中均存在表达，并且公鸡与母鸡表达的趋势基本相同。

由图3可知，公鸡胸肌和腿肌中各个周龄TGFB2基因的表达量的差异均不显著；下丘脑组织中，各个周龄的表达量彼此之间差异极显著(P<0.01)，其中6周龄的表达量最高，10周龄次之；垂体组织中，10周龄的表达量显著低于2周龄(P<0.05)，其余周龄间差异不显著。

由图4可知，母鸡胸肌中10周龄TGFB2基因的表达量极显著高于2周龄和6周龄的表达量(P<0.01)；腿肌组织中，各周龄差异不显著；下丘脑组织中，6周龄的表达量显著高于2周龄的表达量(P<0.05)，其余周龄差异不显著；垂体组织中，10周龄的表达水平极显著低于2周龄(P<0.01)，其余周龄间差异不显著。

2.2.3 TGFB2基因在不同鸡种各周龄表达量的差异

TGFB2基因在2周龄不同鸡种公鸡和母鸡胸肌、腿肌、下丘脑、垂体组织表达的差异见图5与图6，均以大恒肉鸡为对照。

由图5可知，金阳丝毛鸡公鸡胸肌组织中TGFB2基因的表达量与大恒鸡之间差异不显著；大恒鸡腿肌组织中的表达量显著高于金阳丝毛鸡(P<0.05)；在下丘脑、垂体组织中，各鸡种的表达量均不显著。由图6可知，大恒鸡母鸡胸肌组织中TGFB2基因的表达量极显著高于金阳丝毛鸡(P<0.01)；金阳丝毛鸡腿肌组织中的表达量显著低于大恒鸡(P<0.05)。综上分析，在2周龄不同鸡种的公鸡和母鸡在不同组织中的表达趋势不同，说明TGFB2基因在不同鸡种的公鸡和母鸡中各有优势表达组织。

图3 TGFB2基因在金阳丝毛鸡公鸡不同时期、组织的相对表达量Figure 3 Relative expression of TGFB2 at different tissues and ages of male Jinyang Silky Chicken

图4 TGFB2基因在金阳丝毛鸡母鸡不同时期、组织的相对表达量Figure 4 Relative expression of TGFB2 at different tissues and ages of female Jinyang Silky Chicken

图5 TGFB2基因2周龄公鸡不同鸡种、组织的表达量Figure 5 Relative expression of TGFB2 at different breeds and ages of male in 14d

图6 TGFB2基因2周龄母鸡不同鸡种、组织的表达量Figure 6 Relative expression of TGFB2 at different breeds and ages of female in 14d

TGFB2基因在6周龄不同鸡种公鸡和母鸡胸肌、腿肌、下丘脑、垂体组织表达的差异如图7与图8所示。

由图7可知，在6周龄各鸡种公鸡胸肌、腿肌、下丘脑、垂体组织中TGFB2基因的表达量均差异不显著。由图8可知，6周龄各鸡种母鸡胸肌、腿肌、下丘脑组织中TGFB2基因的表达量差异均不显著，大恒鸡垂体组织中的表达量显著低于金阳丝毛鸡(P<0.05)。综上分析，在6周龄各鸡种不同组织间虽均有表达但差异不大，表达趋势一致。

TGFB2基因在10周龄不同鸡种公鸡和母鸡胸肌、腿肌、下丘脑、垂体组织表达的差异如图9与图10所示。

由图9可知，10周龄不同鸡种公鸡胸肌、腿肌、下丘脑、垂体组织中TGFB2基因的表达量差异不显著。由图10可知，10周龄金阳丝毛鸡母鸡胸肌、垂体组织中TGFB2基因的表达量极显著高于大恒鸡(P<0.01)；腿肌、下丘脑组织中的表达各个鸡种间差异均不显著。综上分析，在母鸡中，金阳丝毛鸡的胸肌为优势表达组织。

图7 TGFB2基因6周龄公鸡不同鸡种、组织的表达量Figure 7 Relative expression of TGFB2 at different breeds and ages of male in 42d

图8 TGFB2基因6周龄母鸡不同鸡种、组织的表达量Figure 8 Relative expression of TGFB2 at different breeds and ages of female in 42d

图9 TGFB2基因10周龄公鸡不同鸡种、组织的表达量Figure 9 Relative expression of TGFB2 at different breeds and ages of male in 70d

图10 TGFB2基因10周龄母鸡不同鸡种、组织的表达量Figure 10 Relative expression of TGFB2 at different breeds and ages of female in 70d

3 讨论

TGF-β 超家族包含 3种亚型，TGF-β2(transforming growth factor，beta 2)是其中的成员。TGF-β 是具有多种功能的细胞生长因子，能调节形态发生[2]、发育、分化[3]等生命活动，并对于骨骼肌成肌细胞的增殖具有深远的影响。目前主要集中于TGFB/Smad3信号转导通路所引起的疾病[4-6]和治疗[7]方面的研究。有关TGFB2与鸡肌肉生长发育的研究较少。因此，本研究为此提供了理论基础。

Li H等[8]研究该基因的多态性对鸡生长与体组成性状的作用时发现，该基因在鸡生长和发育中具有广泛的影响。de Mello F等[9]在鱼肌肉上表达研究发现，tgf-β2基因能动态调节肌肉生长修复以及卫星细胞的分化，证实该基能调节肌肉生长和发育。Lu Y 等[10]采用 q-PCR 技术研究 TGF-β2、TGF-β3以及FGF2基因在胚胎期10d、孵化当天、出生后45d肉鸡和蛋鸡腿肌组织的表达差异，结果发现这些基因均在胚胎期的表达极显著高于其余的阶段(P<0.01)。由此说明，在鸡胚胎期以及出生后的一定阶段该基因对腿肌组织的表达调控处于高峰期，并可能对鸡腿肌的成肌细胞的增殖起重要作用。

该基因在不同品种组织中差异表达分析发现，2周龄大恒鸡腿肌中TGFB2 mRNA表达量显著高于金阳丝毛鸡，并且达到最高值。10周龄金阳丝毛鸡母鸡胸肌组织中TGFB2 mRNA表达量均显著高于大恒鸡，并达到最高值；大恒鸡公鸡10周龄腿肌组织中TGFB2 mRNA表达量均与其他周龄差异显著，并达到最高值。金阳丝毛鸡、大恒鸡母鸡10周龄胸肌组织中TGFB2 mRNA表达量均显著高于2周龄。金阳丝毛鸡各周龄的表达模式与大恒鸡种不同，仅在6周龄下丘脑组织有显著高表达(P<0.05)，并且在垂体组织的表达值最低。下丘脑为内分泌系统和神经系统的中心，与垂体组成完整的神经内分泌功能系统，其中的腺垂体可分泌生长激素(GH)，进而促进肌肉增生和动物的生长。该生长因子在金阳丝毛鸡下丘脑高表达，释放抑制激素，抑制腺垂体合成生长激素，从而抑制金阳丝毛鸡在该阶段的生长发育。因此推测TGFB2基因可作为影响鸡肌肉生长发育的候选基因。

[1] MASSAGUE J，BLAIN S W，LO R S.TGF-β signaling in growth control，cancer，and heritable disorders[J].Cell，2000，103：295.

[2] YAMAGISHI T，ANDO K，NAKAMURA H，et al.Expression of the Tgfβ2 gene during chick embryogenesis[J].Anat Rec(Hoboken)，2012，295(2)：257-267.

[3] SCHABORT E J，VAN DER MERWE M，LOOS B，et al.TGF-beta's delay skeletal muscle progenitor cell differentiation in an isoform-independent manner[J].Exp Cell Res，2009，315(3)：373-384.

[4] 于蓉，岑瑛.TGF-β_1/Smad3信号转导通路与创伤后瘢痕形成[J].中国修复重建外科杂志，2012，26(3)：330-335.

[5] BIRESSI S，MIYABARA E H，GOPINATH S D，et al.Wnt-TGFβ2 axis induces a fibrogenic program in muscle stem cells from dystrophic mice[J].Sci Transl Med，2014，6(267)：267 ra176.

[6] KATSUNO M，ADACHI H，BANNO H，et al.Transforming growth factor-β signaling in motor neuron diseases[J].Curr Mol Med，2011，11(1)：48-56.

[7] 张爱军，闫志勇.TGF-β对创伤愈合与瘢痕形成的影响及中药的干预作用[J].西北药学杂志，2013，28(1)：101-105.

[8] LI H，DEEB N，ZHOU H，et al.Chicken quantitative trait loci for growth and body composition associated with transforming growth factor-beta genes[J].Poult sci，2003，82(3)：347-356.

[9] DE MELLO F，STREIT D P JR，SABIN N，et al.Dynamic expression of tgf-β2，tgf-β3 and inhibin βA during muscle growth resumption and satellite cell differentiation in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)[J].Gen Comp Endocrinol，2015，210：23-29.

[10] LU Y，CHEN S，YANG N.Expression and methylation of FGF2，TGF-β and their downstream mediators during different developmental stages of leg muscles in chicken[J].PLoS One，2013，8(11)：e79495.

Tissue-specific Expression of the Daheng Chicken and Jinyang Silky Chicken TGFB2 Gene

ZHANG Zeng-rong1，2，3，DU Hua-rui1，2，LI Qing-yun1，2，YANG Chao-wu1，2，QIU Mo-han1，2，JIANG Xiao-song1，2，3*
(1.Sichuan Animal Science Academy，Chengdu 610066，China；2.Sichuan Daheng Poultry Breeding Company，Chengdu 610066，China；3.Animal Breeding and Genetics Key Laboratory of Sichuan Province，Chengdu 610066，China)

【Objective】 The aim of this study is to detect the impact of the TGFB2 on chicken meat flavor traits.【Method】In this study，we quantified chicken TGFB2 gene expression in Daheng chicken and Jinyang Silky Chicken，to discern the tissue and ontogenic expression pattern and its effect on muscle development.Real-time quantitative PCR assay was developed for accurate measurement of the TGFB2 mRNA expression in various tissues from chickens of different ages(2，6 and 10 week).【Results】The result showed that expression of the TGFB2 mRNA was detected in all tissues，regardless of age.The leg muscle tissues of Daheng chicken had the higher expression of the TGFB2 gene than that of Jingyang Silky chicken at 2 week(P<0.05).The breast muscle tissues of had the higher expression of the TGFB2 gene than that of Daheng chicken at 10 week(P<0.05).The leg muscle tissues of Daheng chicken had the highest expression of the TGFB2 gene at 10 week.The breast muscle tissues of Daheng chicken and Jingyang Silky chicken had the higher expression of the TGFB2 gene at 10 week than that at 2 week(P<0.05).【Conclusion】We speculated that the chicken TGFB2 gene may be related to chicken development.

chicken；TGFB2gene；real-timePCR；tissueexpression

Q954.6

A

1000-2650(2017)01-0081-07

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.01.012

2016-08-25

四川省科技支撑计划(2015NZ0101)；四川省基本科研业务专项(SASA2014A10)；四川省科研院所成果转化项目(15010126)。

张增荣，男，博士，副研究员，主要从事家禽遗传育种，E-mail：zhangzengrong2004@163.com；*责任作者：蒋小松，博士，研究员，主要从事家禽遗传育种，E-mail：xsjiang@sasa.cn。

(本文审稿：刘益平；责任编辑：秦碧雯；英文审稿：刘益平)