黄宇良 汪立平, 陆克文 邵会娟 王正全
(1. 上海海洋大学食品学院 食品热加工工程技术研究中心,上海 201306;2. 上海海洋大学食品学院 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306;3. 上海邦成生物工程有限公司,上海 201506)
片球菌素pedA基因的原核表达、纯化及生物信息学分析
黄宇良1汪立平1,2陆克文3邵会娟3王正全2
(1. 上海海洋大学食品学院 食品热加工工程技术研究中心,上海 201306;2. 上海海洋大学食品学院 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306;3. 上海邦成生物工程有限公司,上海 201506)
旨在构建片球菌素PA-1结构基因pedA的原核表达载体,在大肠杆菌体系中实现PA-1的外源表达,运用生物信息学手段分析重组蛋白的理化性质及分子结构。以戊糖片球菌C-2-1的DNA为模板,扩增pedA基因,扩增产物克隆入pET28a(+)原核表达载体,构建pET28a-pedA重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)中;30℃,以1 mmol/L IPTG 诱导表达5 h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,检测纯化后重组蛋白的抑菌活性;利用生物信息学手段探究重组蛋白的理化性质及分子结构信息。结果显示,pET28a-pedA重组质粒构建成功,带有His标签的PA-1重组片球菌素在大肠杆菌中实现了可溶性表达,利用Ni-NTA亲和层析获得纯化的重组蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳分析表明纯化后的重组蛋白分子量约为7.8 kD,与理论值相符。琼脂扩散法抑菌活性实验抑菌圈效果明显,表明纯化的重组片球菌素具有抑菌活性。生物信息学方法对比分析其蛋白结构发现,获得的重组蛋白含有信号肽,α螺旋占23.53%,疏水性提高,可能促进了重组蛋白的可溶性表达。该实验成功构建了片球菌素PA-1的原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的可溶性表达,该表达可能与其含有信号肽及信号肽疏水性有关,纯化后的重组蛋白抑菌活性明显。
pedA基因;片球菌素PA-1;原核表达;抑菌活性;生物信息学
近年来食品安全事件频发,其中由微生物引起的食品腐败和食源性疾病占很大一部分比例,化学防腐剂的添加可有效抑制食品中的腐败微生物,但防腐剂的滥用又造成了新的食品安全问题,因此寻找安全无毒副作用的天然食品防腐剂显得尤为重要。乳酸菌细菌素是由乳酸菌通过核糖体合成机制,在代谢过程产生的一类具有抑菌活性的前体多肽或多肽,通常乳酸菌对其自身所产细菌素具有免疫性[1-2]。因细菌素对人体无危害,可被胃肠道内蛋白酶降解消化,具有作为食品生物防腐剂的潜在应用价值[3-4]。乳酸菌细菌素可分为4大类:第一类被称为羊毛硫细菌素,是一类小分子的修饰肽;第二类是小分子热稳定肽,其代表为乳酸链球菌产生的乳酸链球菌素Nisin,已在包括我国在内的许多国家获得许可并在食品工业中推广应用[5];第三类是被称为溶菌素的大分子热不稳定蛋白;第四类是复合型的大分子复合物。其中第二类细菌素又可分为3个亚类,其中的IIa类是类片球菌细菌素,主要由戊糖片球菌、乳酸片球菌、小片球菌产生。这类细菌素相比于Nisin 在pH6.0 时就有90% 以上的活性丧失的特点,其性质更稳定[6],抑菌谱较广,对单增李斯特菌的抑制作用尤为明显[7-8],在食品防腐保鲜领域中具有更广泛的应用前景。
类片球菌素中的片球菌素PA-1是目前继Nisin之后第二个被用于商业开发的细菌素[9],其相关基因是大小为9.4 kb的质粒pSRQ11,由4个基因簇构成一个操纵子,分别为pedA,pedB,pedC,pedD基因,pedA基因为结构基因,编码62个氨基酸的PA-1前体,其成熟且有活性的片球菌素是由第19-62个氨基酸组成的44个氨基酸残基和2个二硫键组成。其余3个基因分别为免疫基因、分泌基因、加工基因,它们不涉及片球菌素的产生[10]。天然菌株片球菌素的表达量低,不易纯化,难以实现产业化,化学合成法虽然能够生产足够量的细菌素,但成本高、活性不稳定[11]。采用基因工程技术将片球菌素基因克隆到细菌等宿主内进行异源高效表达是近年来细菌素领域的研究热点。如Moon等[12]在E.coli内成功表达了无活性的His-tag-仓鼠二氢叶酸还原酶-乳酸片球菌素PA-1,纯化后的融合蛋白经酶切后恢复抑菌活性;刘珊娜[11]和陈信全等[13]分别在E. coli BL21(DE3)和E. coli Rosetta(DE3)内实现了片球菌素PA-1的异源融合表达;韩烨等[14]也成功实现了乳酸片球菌素pedA基因在E.coli体内的表达。以真菌为宿主异源表达细菌素近来也有报道,van Reenen等[15]利用酿酒酵母表达 Plantaricin 423,其工程菌表现出了抑菌活性;Beaulieu等[16]在毕赤酵母中也实现了无生物活性的片球菌素的高效表达。
本实验室前期从内蒙古干酪中筛选出一株戊糖片球菌C-2-1菌株,经证实该菌株能产生片球菌素[6]。本研究以此戊糖片球菌C-2-1菌株的总DNA为模板,设计引物扩增片球菌素PA-1成熟肽的结构基因pedA,构建pET28a-pedA重组质粒,在E.coli细胞内表达重组片球菌素PA-1,利用李斯特氏菌抑菌活性检验纯化后获得的重组片球菌素PA-1,运用生物信息学工具分析了重组蛋白的理化特性和结构信息,以期为片球菌素PA-1的体外高效表达和后期在食品中的应用奠定基础。
1.1.1 菌株与质粒 戊糖片球菌C-2-1(Pediococcus pentosaceus C-2-1)由本实验室自行分离获得,表达载体 pET-28a(+)、大肠杆菌 Top10、BL21(DE3)、指示菌单增李斯特菌(L. monocytogenes ATCC19114)均由本实验室保藏。
1.1.2 试剂与培养基 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自北京全式金生物技术有限公司;限制性内切酶、质粒提取试剂盒、琼脂糖胶回收试剂盒、Ni-NTA Agarose、卡那霉素、Tris、异丙基 -β-D-硫代半乳糖甘(IPTG)、X-Gal、琼脂糖、溶菌酶等均购自上海生工生物工程有限公司;DNA marker、蛋白marker购自中科瑞泰生物科技有限公司;胰蛋白胨、酵母粉购自OXOID公司,氯化钠、甘油、吐温-80等购自国药。LB液体培养基(g/L):胰蛋白胨 10.0、酵母粉 5.0、氯化钠 10.0,121℃灭菌15 min,用于大肠杆菌的培养;MRS培养基(g/L):葡萄糖 20.0,蛋白胨 10.0,酵母粉 10.0,牛肉膏 5.0,磷酸氢二钾2.0,柠檬酸铵 2.0,无水乙酸钠 5.0,七水硫酸镁 0.58,水合硫酸锰 0.25,吐温-80 1.0,pH 6.2-6.6,121℃灭菌15 min,用于戊糖片球菌C-2-1的培养;TSBYE液体培养基(g/L):胰蛋白胨 17.0,大豆蛋白胨3.0,酵母粉 6.0,氯化钠 5.0,磷酸氢二钾 2.5,葡萄糖 2.5,调pH 7.3±0.1,121℃灭菌15 min。TSBYE固体培养基(g/L):配方同上,加入琼脂粉1.0%。用于指示菌单增李斯特菌的培养。
1.2.1 引物设计及基因扩增 根据GenBank中上传的可产片球菌素细菌的基因进行对比,找到编码片球菌素PA-1的pedA结构基因的全序列(GenBank登录号:AY083244.3),设计正向引物pedA-F:5'-CATGCCATGGAAAAAATTGAAAAATTAACTGAA AAAGAA-3'(划线部分为Nco I酶切位点,前面为保护碱基和启动子)。反向引物pedA-R:5'-CCCAA GCTTCTAGTGATGATGGTGATGATGGCATTTATGA TTACCTTGATGTCCA-3'(划线部分为Hind III酶切位点,前面为保护碱基,后面加有His标签),由生工生物工程(上海)有限公司合成。以戊糖片球菌C-2-1总DNA为模板,设计引物进行PCR扩增。PCR反应条件为:95℃预变性10 min;95℃变性30 S,55℃退火30 S,72℃延伸45 S,循环30 次;72℃后延伸10 min。PCR 产物以1.5% 的琼脂糖凝胶电泳进行检测,切下凝胶上目的条带后,用DNA 回收试剂盒回收纯化。
1.2.2 重组质粒pET28a-pedA的构建 将回收的PCR 产物和pET-28a(+)质粒用限制性内切酶Nco I和Hind III双酶切,回收酶切产物,利用T4 DNA 连接酶将双酶切后的pedA 基因和pET-28a(+)质粒进行连接,连接产物转化至Top10大肠杆菌感受态细胞,在含有卡那霉素抗性的LB 平板中筛选阳性转化子。挑出单克隆接种LB液体培养基培养,提取质粒,将质粒用Nco I和Hind III双酶切鉴定,鉴定正确后送至上海生工公司进行DNA测序。
1.2.3 重组球菌素PA-1的诱导表达 将测序正确的重组质粒pET28a-pedA转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,挑取单菌落于含卡那霉素(终浓度50 μg/mL)的LB培养基中,37℃、200 r/min摇床培养至对数生长期(OD600nm=0.6),加入终浓度1 mmol/L IPTG,30℃振荡培养5 h,4℃离心收集细胞并洗涤后,加入细胞裂解液(终浓度为50 mg/mL)和溶菌酶(终浓度为1 mg/mL)。冰浴超声裂解细胞,高速离心后分别取上清和沉淀进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析,检测重组蛋白的表达形式,收集上清和沉淀保存备用。1.2.4 重组球菌素PA-1蛋白的纯化 取1 000 μL的Ni-NTA His-Bind树脂混合液加入空纯化柱中,用蒸馏水重悬珠子,待水从纯化柱下方流出后,用 Binding buffer(NaH2PO450 mmol/L,NaCl 500 mmol/L,咪唑10 mmol/L,最终调pH 为8.0)重悬,重复2 次,备用;将离心得到的细胞破碎上清加入含有琼脂糖珠子的纯化柱中,4℃在旋转仪上与珠子孵育2 h后,将上清从纯化柱下方流出;用Wash buffer(NaH2PO450mmol/L,NaCl 500 mmol/L,咪唑20 mmol/L,最终调pH 为8.0)洗涤树脂,重复3 次;漂洗完毕后用Elution buffer(NaH2PO450 mmol/L,NaCl 500 mmol/L,咪唑 250 mmol/L,最终调 pH 为 8.0)洗脱蛋白,每200 μL 洗脱1 次,重复2 次,分别取5 μL洗脱液进行Tricine-SDS-PAGE胶分析。
1.2.5 戊糖片球菌素PA-1的活性检测 以单核细胞增生李斯特氏菌为指示菌,采用琼脂扩散法检测表达片球菌素的活性。取50 μL第二次洗脱液样品经0.22 μm滤膜过滤除菌,注入接种有新鲜过夜单核细胞增生李斯特菌菌液(37℃条件下培养16 h)的TSB固体平板上的琼脂孔(约3 mm)中,对照组琼脂孔加入洗脱重组蛋白时使用的相同洗脱液。在超净工作台上静止1 h后,置于37℃培养箱培养12 h,观察抑菌圈。
1.2.6 片球菌素PA-1的生物信息学分析 氨基酸序列利用NCBI网站提供的BLAST工具进行预测(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/),BioEdit工具进行氨基酸序列对比,用ProtParam蛋白在线分析工具和https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html网站二级结构预测工具等对两种蛋白的理化性质和二级结构组成等生物信息学信息进行分析。
以戊糖片球菌C-2-1菌株的总DNA为模板,pedA-F和pedA-R为正反向引物,进行pedA基因PCR扩增,产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,如图1所示,在220 bp 左右有明显条带,与预期片段大小相符,目的基因扩增成功。
图 1 pedA基因的PCR扩增
将双酶切后的pedA 基因和pET-28a(+)质粒进行T4 连接酶连接,产物转化至感受态细胞,筛选阳性转化子接种到LB液体培养基培养,提取质粒。如图2 所示,将重组质粒pET28a-pedA用Nco I和Hind III双酶切后,获得一条220 bp 左右的条带,此条带大小与预期值相符。将双酶切鉴定正确的质粒进行基因测序,测序结果表明连入pET28a质粒中的pedA 基因与GenBank中的pedA 基因碱基序列(GenBank登录号:AY083244.3)完全一致,说明重组质粒pET28a-pedA 构建成功。
图2 阳性重组子双酶切鉴定
将重组质粒pET28a-pedA转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在含有卡那霉素的LB培养基中振荡培养,加入IPTG后降低培养温度诱导表达,震荡培养5 h后,4℃离心收集细胞并洗涤,加入裂解液和溶菌酶。冰浴超声裂解细胞,离心后取上清和沉淀进行电泳分析,检测重组蛋白表达形式,实验结果如图3所示,诱导后的上清和沉淀中在7.8 kD附近有一条明显的条带,与理论值相符。而未转化重组质粒pET28a-pedA的大肠杆菌BL21(DE3)野生菌株在7.8 kD附近无明显条带。表明重组球菌素PA-1蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达成功,且以可溶性蛋白形式存在。
将收集的超声裂解上清液与Ni-NTA 琼脂糖镍柱孵育,带有His 标签的重组球菌素PA-1蛋白会与镍柱特异性结合,经过3次漂洗和2次洗脱后,成功获得纯化的重组球菌素PA-1蛋白(图4)。收集对应洗脱液保存,进行活性检测。
以单核细胞增生李斯特氏菌为指示菌,利用琼脂扩散法鉴定表达重组片球菌素PA-1的活性。结果如图5所示,纯化后的重组片球菌素PA-1抑菌圈明显,而仅含洗脱液的空白对照没有抑菌圈,证明戊糖片球菌素pedA结构基因在大肠杆菌体内成功表达出了有活性的PA-1细菌素。
图3 重组片球菌素PA-1蛋白的Tricine-SDS-PAGE电泳检测
图4 重组片球菌素PA-1蛋白的纯化
鉴于本实验得到的重组蛋白为胞内可溶性表达,而已报道的仅表达成熟且有活性的由44个氨基酸组成(GenBank登录号为BAE79270)的PA-1细菌素前体蛋白,大部分为包涵体不可溶表达。运用生物信息学工具分析预测本实验得到的重组片球菌素PA-1氨基酸序列和 BAE79270 PA-1细菌素两种蛋白的理化性质、结构特征等内容,推测本实验重组蛋白在大肠杆菌体内可溶性表达的可能原因。
2.6.1 片球菌素PA-1的理化性质分析 本实验成功表达的重组片球菌素PA-1氨基酸序列为:MKKI EKLTEKEMANIIGGKYYGNGVTCGKHSCSVDWGKAT TCIINNGAMAWATGGHQGNHKCHHHHHH,由68个氨基酸(其中含划线部分6个组氨酸组成的His标签)组成。登录号为BAE79270的PA-1细菌素由44个氨基酸组成,其氨基酸序列为:KYYGNGVTC GKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGGHQGNHKC。BioEdit分析发现两者之差别在于本研究多了氨基酸序列MKKIEKLTEKEMANIIGG,其他序列相同。
图5 重组片球菌素的抑菌活性验证
用ProtParam蛋白在线分析工具分析BAE79270的PA-1细菌素氨基酸序列,结果表明,其分子式为C196H297N61O60S5,分子量为4 628.19,理论pI(等电点)值为8.85,同时含有1个负电荷氨基酸(Asp +Glu)和4个正电荷氨基酸(Arg + Lys),脂肪系数为40.00,总平均亲水值(GRAVY)为-0.716,不稳定性系数为-0.48。用相同方法分析本实验成功表达的重组片球菌素PA-1氨基酸序列,结果表明,其分子式为C319H489N101O94S7,分子量为7 467.43,理论pI值为8.42,含有5个负电荷氨基酸(Asp + Glu)和7个正电荷氨基酸(Arg + Lys),脂肪系数为50.29,总平均亲水值为-0.716,不稳定性系数为23.65,属于稳定型细菌素。两种蛋白的氨基酸组成见表1。
2.6.2 片球菌素PA-1的二级结构预测 利用二级结构预测工具对片球菌素PA-1进行二级结构预测。各参数设置为:视窗宽度为17,相似度阈值为8,状态数目为4。经分析:登录号为BAE79270的PA-1细菌素的二级结构(图6)中,无α螺旋结构;延伸链占40.91%,有18个氨基酸残基参与;β转角占13.64%,有6个氨基酸残基参与;无规则卷曲占45.45%,共有20个氨基酸残基参与。
本实验成功表达的重组片球菌素PA-1的二级结构(图7)中,α螺旋占23.53%,有16个氨基酸残基参与;延伸链占20.97%,有13个氨基酸残基参与;β转角占12.90%,有8个氨基酸残基参与,无规则卷曲占40.32%,共有25个氨基酸残基参与。
对比预测结果后发现,本实验重组片球菌素PA-1的二级结构中含有23.53%的α螺旋结构,而由44个氨基酸组成的成熟且有活性的PA-1细菌素的二级结构中不含有α螺旋结构。
表1 两种不同片球菌素PA-1的氨基酸组成
图6 BAE79270片球菌素PA-1的二级结构预测
图7 本实验片球菌素PA-1的二级结构预测
采用基因工程技术来提高片球菌素的效价是可行的,但还存在一定问题。已报道的片球菌素PA-1在大肠杆菌中的表达形式多为细胞内不溶性表达,产物通常存在于包涵体中,包涵体溶解、变性、复性等过程复杂,导致表达效率降低[17]。刘珊娜等[11]在E. coli BL21(DE3)内实现了Trx-PA-1的融合表达,重组片球菌素以包涵体的形式存在,限制了PA-1进一步应用。此外,引入分子伴侣或运用融合表达的方法来实现PA-1的可溶性表达,也是学者常用的一种细菌素异源表达的方法,但获得的重组蛋白要经过肠激酶酶切去除标签蛋白后才能恢复活性。陈信全等[13]利用GST系统,通过在GST和PA-1蛋白间引入His标签实现了融合蛋白的可溶性表达,重组PA-1经过肠激酶去除标签蛋白后活性才得以恢复,制约了其在食品工业中的应用。本研究构建了pET28a-pedA重组质粒,转入大肠杆菌后经诱导表达、Ni-NTA柱纯化、Tricine-SDS-PAGE电泳分析后[18],获得了分子量在7.8 kD左右的可溶性重组蛋白,与ProtParam蛋白分析工具的分子量预测值相符。经单增李斯特菌抑菌检测显示,重组片球菌素具有明显的抑菌活性。本实验成功表达的可溶性重组片球菌素PA-1,未加入融合蛋白或分子伴侣,使重组片球菌素的提取和纯化更加简便,为片球菌素PA-1在食品防腐保鲜领域的应用奠定了很好的基础。
Marugg等[10]证实pedA基因编码PA-1片球菌素62个氨基酸的PA-1前体,第19-62个氨基酸为具有活性的片球菌素前体,前18个氨基酸为信号肽序列,与刘珊娜[11]包涵体表达的片球菌素PA-1相比,本实验成功表达的重组片球菌素PA-1含有此信号肽序列。研究表明分泌蛋白的N端都携带有引导其跨越细胞膜的信号肽,它对于分泌蛋白的分泌效率起主导作用[19],利用信号肽来引导外源蛋白定位分泌到细胞特定区间,提高可溶性,可避免因包涵体复性带来的困难[20]。因此,本实验获得的重组片球菌素PA-1含信号肽可能是导致其可溶性表达的原因。进一步比较两种PA-1的理化性质及二级结构后发现,未含信号肽的BAE79270的PA-1细菌素没有α螺旋结构,含有信号肽的片球菌素PA-1的α螺旋结构占23.53%,重组蛋白疏水性提高。据文献报道,信号肽分泌加工能力随疏水性增加而提高,前体蛋白可以不依赖分子伴侣或其他辅助因子仍能较好的分泌[21]。杨运桂等[22]证实信号肽疏水性能提高促进青霉素G 酰化酶分泌。因此,本实验获得的重组PA-1蛋白含有的疏水核心信号肽可能促进了重组蛋白的分泌,从而获得了较稳定的重组蛋白,使提取和纯化更为简单。
本实验成功构建了片球菌素PA-1结构基因pedA的原核表达载体,纯化得到了可溶性表达并具有抑菌活性的重组片球菌素PA-1。运用生物信息学手段,进一步分析了重组片球菌素PA-1可溶性表达的原因可能为含有信号肽的PA-1的重组蛋白疏水性提高,促进了重组蛋白的分泌。
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Prokaryotic Expression,Purification and Bioinformatics Analysis of Pediocin pedA Gene
HUANG Yu-liang1WANG Li-ping1,2LU Ke-wen3SHAO Hui-juan3WANG Zheng-quan2
(1. College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Engineering Research Center of Food Thermal-processing Technology,Shanghai 201306 ;2. College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation,Shanghai 201306 ;3. Shanghai Bangcheng Biotechnology Co. Ltd.,Shanghai 201506)
The aim of this study is to construct a prokaryotic expression vector for pedA gene of pediocin PA-1 to realize the exogenous expression of PA-1,and to analyze the physicochemical properties and molecular structure of recombinant protein by bioinformatics. The pedA gene was amplified by DNA of Pediococcus pentosaceus C-2-1 as template,and the PCR product was cloned into prokaryotic expression vector pET28a(+). The recombinant plasmid pET28a-pedA was thus constructed and transformed into Escherichia coli BL21(DE3)competent cells. Next,the transformant was induced to express protein by IPTG(1 mmol/L)at 30℃ for 5 h. Then,the recombinant protein was purified by Ni-NTA resin affinity chromatography,and the antibacterial activity of the recombinant protein was detected. Finally,the physicochemical properties and molecular structure of recombinant protein was explored by bioinformatics method. The results showed that the recombinant plasmid pET28a-pedA was successfully constructed,and recombinant pediocin of PA-1 with His-tag was expressed in E. coli. The molecular size of the purified recombinant protein by Ni-NTA affinity chromatography was determined to be about 7.8 kD via Tricine-SDS-PAGE,whichwas consistent with the theoretical value. Agar diffusion method demonstrated that antibacterial colony was remarkable,indicating that the purified recombinant pediocin had antibacterial activity. Comparative analysis of the protein structure and characteristics by bioinformatics method showed that the recombinant protein contained the signal peptide and consisted of 23.53% alpha helix,meaning that its hydrophobicity increased,thus which might enhance the soluble expression of the recombinant protein. Conclusively,in this experiment,the prokaryotic expression vector of pediocin PA-1 was successfully constructed,and the recombinant protein was at soluble expression in E. coli. The soluble expression may be related to signal peptide and the hydrophobicity of the signal peptide,and the antibacterial activity of the purified recombinant protein was significant.
pedA gene;pediocin PA-1;prokaryotic expression;antibacterial activity;bioinformatics
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0373
2017-05-09
国家自然科学基金青年基金项目(31401486),上海市科学技术委员会工程中心建设项目(11DZ2280300)
黄宇良,男,硕士研究生,研究方向:食品生物技术;E-mail:791313564@qq.com
汪立平,女,博士,副教授,研究方向:食品生物技术;E-mail:lpwang@shou.edu.cn
(责任编辑 狄艳红)