黄赭色链霉菌固体菌剂的研制及其对小麦幼苗生长的影响

何文 刘金龙 寇娟妮 汤正帅 刘丽英 孙中涛

（1. 山东农业大学泉林黄腐酸肥料工程实验室，泰安 271018；2. 山东农业大学生命科学学院，泰安 271018）

黄赭色链霉菌固体菌剂的研制及其对小麦幼苗生长的影响

何文1，2刘金龙2寇娟妮2汤正帅2刘丽英2孙中涛1，2

（1. 山东农业大学泉林黄腐酸肥料工程实验室，泰安 271018；2. 山东农业大学生命科学学院，泰安 271018）

为了提高黄赭色链霉菌SN16菌剂的生物稳定性，通过对其载体、保护剂和分散剂等助剂的用量进行优化，确定最佳配方，并采用盆栽试验研究其对小麦幼苗生长的影响。结果表明，黄赭色链霉菌SN16菌剂的最佳配方以重量百分比计为：黄赭色链霉菌SN16原粉20%，海藻酸钠溶液（1 mg/mL）24%，羧甲基纤维素钠溶液（10 mg/mL）24%，硅藻土32%。在此条件下，在4℃保存60 d后菌剂的生物量为2.45×108CFU/g，常温保存下60 d后其生物量能达0.94×108CFU/g。盆栽实验结果表明，与对照相比，施用1%浓度的黄赭色链霉菌SN16菌剂的小麦幼苗的株高、株鲜重和株干重分别提高了9.85%、57.90%、66.67%，均达到了显著水平（P＜0.05）；但对根长的促生作用未达到显著水平（P＞0.05）。研究结果为农业生产提供一种新型的黄赭色链霉菌菌剂。

黄赭色链霉菌；微生物菌剂；助剂；小麦；幼苗生长

为了实现农产品的高产和稳产，农业生产过程往往会大量的施用化学肥料和农药，致使生态环境日趋严重［1］。为了农业的可持续发展，现代农业向绿色农业、生态农业方向转变已成为必然，微生物菌剂在其中的作用也日趋突出［2］。近年来，微生物菌剂被广泛的应用于生物防治中，迄今已有木霉菌［3］、枯草芽孢杆菌［4］和哈茨木霉［5］等微生物菌剂的相关报道，但关于黄赭色链霉菌菌剂的研制尚属空白。

由于微生物菌剂对外界环境因素（湿度、温度和光照等）比较敏感，容易导致菌剂储存的稳定性差［6］，因此在实际生产微生物菌剂的过程中，可通过添加一些助剂来提高菌剂的稳定性，延长菌剂的保存期限［7］。目前国内外已有关于助剂对假单胞菌菌剂［8-9］、解淀粉芽孢杆菌BA-12可湿性粉剂［10］等的相关报道，而关于助剂对黄赭色链霉菌菌剂的影响鲜有报道。黄赭色链霉菌SN16为本实验室分离筛选并保藏的放线菌，对水稻恶苗病菌、层出镰刀菌、尖孢镰刀菌等有较好的拮抗作用。

因此，本试验将在前期研究工作的基础上，根据黄赭色链霉菌SN16的特性，对载体、保护剂和分散剂等进行筛选，旨在研发出一种便于贮藏的黄赭色链霉菌SN16菌剂，并探究其对小麦幼苗生长的影响，为新型的黄赭色链霉菌SN16菌剂的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株为黄赭色链霉菌SN16，由山东农业大学微生物工程实验室提供；供试小麦品种：“优麦2号”，购自购自泰安市泰山区农大种业。

供试试剂：小米粉、麦麸、硅藻土、非耕作层黄土、高岭土、碳酸钙、碳酸镁、几丁质、羧甲基纤维素钠（CMC）、海藻酸钠、腐植酸、十二烷基硫酸钠（SDS）、Tween-80。培养基：高氏 1 号培养基［11］，固体培养基（小米粉麦麸培养基）。

1.2 方法

1.2.1 黄赭色链霉菌SN16种子液的制备 将保藏的黄赭色链霉菌SN16接入高氏1号培养基平板上活化，28℃培养3 d。然后将菌株SN16接种于装有

100 mL高氏1号液体培养基的三角瓶（250 mL）中，于28℃，180 r/min条件下培养48 h，备用。

1.2.2 黄赭色链霉菌SN16原粉的制备 以黄赭色链霉菌SN16固态发酵制备原粉，即80%小米粉与20%麦麸混匀，加入蒸馏水，使初始含水量达到50%，接种量10%，pH自然，28℃培养7 d。待发酵完成后取出培养物，于35℃恒温鼓风干燥。粉碎后即为黄赭色链霉菌SN16原粉，备用。

1.2.3 不同载体对黄赭色链霉菌SN16生长的影响 选用硅藻土、非耕作层黄土、高岭土、碳酸钙、几丁质和碳酸镁等6种材料作为载体，分别以5%的量添加到含该菌的液体高氏1号培养基中，于28℃，180 r/min培养48 h。采用平板菌落计数法［11］，并观察不同载体下SN16菌落生长情况。

1.2.4 载体对黄赭色链霉菌SN16菌剂的影响 在1.2.3的基础上，将对菌株SN16生长具有促进作用的载体以5∶8的比例与黄赭色链霉菌SN16原粉混合，分别包裹于牛皮纸中，以不添加载体的处理组为对照（CK），置于54℃培养7 d，采用平板菌落计数法测定各处理的存活率。每个处理重复3次。

1.2.5 保护剂的筛选 以腐植酸、海藻酸钠作为保护剂，根据其化学性质，分别配制成0.1%、0.5%和1%浓度的溶液，以5∶6的比例与黄赭色链霉菌SN16原粉混合，并于54℃培养7 d。采用平板菌落计数法测定各处理的存活率，每个处理重复3次。

1.2.6 分散剂的筛选 以十二烷基硫酸钠（SDS）、Tween-80和羧甲基纤维素钠（CMC）为分散剂，分别配制成0.1%、0.5%和1%浓度的溶液，以5∶6的比例与黄赭色链霉菌SN16原粉混合，并于54℃培养7 d。采用平板菌落计数法测定各处理的存活率，每个处理重复3次。

1.2.7 贮存时间对黄赭色链霉菌SN16菌剂的影响 将优化后的载体、保护剂和分散剂按比例与黄赭色链霉菌SN16原粉混合，分别置于28℃和4℃的环境中储存，以不添加任何物质的原粉为对照组（CK），于1、7、15、30、45和60 d时定期取样，采用平板菌落计数法测定各处理的活菌数。每个处理重复3次。

1.2.8 黄赭色链霉菌SN16菌剂对小麦幼苗生长的影响 精选大小一致、无病害的小麦种子，经5%的次氯酸钠表面消毒后，播种于含有310 g无菌土的花盆中（下直径10 cm，上直径15.5 cm，高度12.5 cm），每盆10粒种子。待小麦出芽后对其进行根灌处理，分别取5 mL 1%、2%和3%浓度的SN16菌剂浇于小麦根部，对照组施用等量无菌水，采用完全随机排列。培养期间浇灌清水保持土壤湿润，于培养45 d后测定相关指标。

1.2.9 测定项目及方法 采用平板菌落计数法测定相关活菌数，存活率（%）=第n天活菌数/初始活菌数×100%。

从各个处理组随机选取5株小麦幼苗，采用卷尺测定小麦幼苗的株高和根长；采用分析天平测定幼苗的株鲜重；将幼苗于105℃杀青15 min，80℃烘干至恒重后，采用分析天平测定其株干重。

1.2.10 数据处理 试验数据采用SPSS Statistics 22软件分析处理，采用Excel 2010作图，以LSD法做多重比较分析。

2 结果

2.1 黄赭色链霉菌SN16菌粉的助剂优化结果

2.1.1 载体对黄赭色链霉菌菌株SN16活性的影响 由表1所可知，添加硅藻土和非耕作土的处理，SN16菌株的生物量均显著高于对照（P＜0.05），添加碳酸钙和高岭土的处理与CK间的差异不显著（P＞0.05），而添加几丁质和碳酸镁的处理，SN16菌株的生物量均显著低于对照（P＜0.05）。这说明硅藻土与非耕作土对SN16菌株的生长具有促进作用，碳酸钙和高岭土对SN16菌株的生长没有显著影响，而几丁质和碳酸镁对SN16菌株的生长具有抑制作用。因此，硅藻土、非耕作土、碳酸钙和高岭土均可作为载体，而几丁质和碳酸镁不适合作为载体。

表1 不同载体对黄赭色链霉菌SN16生长的影响

2.1.2 不同载体对黄赭色链霉菌SN16菌粉热贮稳定性的影响 硅藻土、非耕作土、碳酸钙和高岭土等4种载体分别和菌粉混匀，于54℃的环境下贮存7 d，发现不同处理的活菌数出现了显著变化（图1）。平均值多重比较结果（α=0.05），以硅藻土、碳酸钙为载体的菌粉与非耕作土、高岭土和空白对照的差异显著。表明硅藻土和碳酸钙对菌株的保护作用较好，7 d后菌剂的活菌数分别是CK的3.04倍和2.08倍；非耕作土和高岭土对菌株的保护作用较差，但活菌数也均高于CK。

图1 不同载体对黄赭色链霉菌SN16菌粉热贮稳定性的影响

2.1.3 保护剂对黄赭色链霉菌SN16菌粉热贮稳定性的影响 由表2可知，腐植酸可以提高菌粉的热稳定性，当腐植酸添加量为0.1%时，黄赭色链霉菌SN16的存活率达36.54%，与CK相比提高了29.73%，但继续增大腐植酸的添加量，黄赭色链霉菌SN16的活菌数减少，存活率降低。从表3可知，在热贮存的条件下，随着海藻酸钠浓度的增加，黄赭色链霉菌SN16的活菌数不断减少，存活率也不断降低，其中0.1%浓度的海藻酸钠对黄赭色链霉菌SN16的保护作用最好，存活率达到64.35%，与CK相比提高了58.00%。这表明适宜添加量的腐植酸和海藻酸钠对SN16菌粉具有保护作用。在热贮存7 d后，添加0.1%海藻酸钠的菌粉的存活率比添加了0.1%腐植酸的菌粉高出27.81%，说明添加0.1%海藻酸钠更利于SN16菌粉的贮藏。因此，本研究选取0.1%的海藻酸钠作为保护剂。

表2 不同浓度的腐植酸对黄赭色链霉菌SN16菌粉的保护作用

表3 不同浓度的海藻酸钠对菌株的保护作用

2.1.4 分散剂对黄赭色链霉菌SN16菌粉热贮稳定性的影响 由表4-6可知，在热贮存条件下，添加CMC、SDS和Tween-80后的菌剂存活率明显高于CK。其中，添加1%的CMC的菌粉的存活率为15.70%，添加1%的SDS菌粉存活率为13.62%，添加1%的Tween-80菌粉存活率为14.31%，均与CK差异显著（P＜0.05）。其中以添加1% CMC的菌粉存活率和活菌数最高，分别比CK提高了9.17%、2.45×108CFU/g，这可能是CMC对孢子的分散和活力的提高都有促进作用。因此，本研究选取1%的CMC为最佳分散剂。

2.1.5 黄赭色链霉菌SN16菌剂有效活菌数的测定 由图2可知，黄赭色链霉菌SN16在添加的助剂中存活情况随着培养时间的延长而发生改变，添加助剂的菌剂的活菌数均高于CK。添加助剂的菌剂在常温（25℃）下，其活菌数下降迅速，但在15 d后活菌数趋于稳定，到60 d时，活菌数为0.94×108CFU/g，存活率达到10.00%。添加助剂的菌剂在4℃的贮存条件下，活菌数下降较为缓慢，到60 d时，其活菌数是2.45×108CFU/g，存活率为24.90%，与不添加任何助剂的CK的存活率相比，高17.34%。说明加入助剂的菌剂比未加入助剂的菌剂更利于贮藏，生物活性更稳定。

表4 不同浓度的CMC对菌株的分散作用

表5 不同浓度的SDS对菌株的分散作用

表6 不同浓度的Tween-80对菌株的分散作用

图2 菌剂有效活菌数测定结果

2.2 黄赭色链霉菌SN16菌剂对小麦幼苗生长的影响

黄赭色链霉菌SN16菌剂对小麦幼苗生长的影响如表7所示。施用1%黄赭色链霉菌SN16菌剂的处理（T1），小麦幼苗的株高比对照提高了9.85%，达到了显著水平（P＜0.05），而施用2%和3%的处理（T2和T3），小麦幼苗的株高与对照差异不显著（P＞0.05）。与对照相比，T1和T2 的根鲜重与根干重均显著增大（P＜0.05）；T1和T2之间，虽然根鲜重差异显著（P＜0.05），但根干重差异并不显著（P＞0.05）；T3的根鲜重与根干重与对照差异不显著（P＜0.05）。综合考虑应用效果和使用成本，宜选择1%为黄赭色链霉菌SN16菌剂最佳施用量。

表7 不同浓度的菌剂对小麦幼苗生长的影响

3 讨论

微生物菌剂的贮存稳定性直接影响其产品质量与应用效果。选择合适的载体和添加保护剂可以提高微生物菌剂的贮存稳定性。硅藻土的主要成分为SiO2，其结构呈微孔状，孔隙度较宽、孔洞排列整齐、吸收性好、比表面积大、耐磨、热稳定好，附着力强，对微生物有保护作用，是生产微生物菌剂常用的载体之一［12-13］。本研究证实硅藻土作为黄赭色链霉菌SN16的载体，其应用效果优于高岭土、碳酸钙、几丁质等常用载体，这与骞天佑［16］报道一致。

放线菌具有适应环境的能力强，能够在植物根系和根周围的土壤中定殖，并产生多种抗生素和分泌多种胞外水解酶［14］，能产生存活时间长的孢子等优点，有利于工业化生产及应用，但放线菌必须与合适的助剂混合到一起，才能发挥更好的作用［15］。许多性状优良的放线菌制剂已经应用于农业生产中，骞天佑等［16］采用添加非耕作层黄土的生防放线菌153活菌剂明显提高了茄子的防病能力；申光辉等［17］研究表明，硅酸钾与密旋链霉菌Act12菌剂配施可显著促进连作草莓生长，提高果实产量及品质。然而目前国内尚无黄赭色链霉菌菌剂的相关报道。本研究盆栽试验表明，施用一定浓度的黄赭色链霉菌SN16菌剂能够有效促进小麦的根长、株鲜重、株干重，这与田琴［18］的研究结果相一致。本研究初步确定了黄赭色链霉菌SN16菌剂的各项组分，并探讨了其对小麦幼苗生长的影响，而对于黄赭色链霉菌SN16菌剂在田间的应用效果如何，后续试验对此将进一步深入研究。

4 结论

通过单因素实验确定了菌剂的最佳配方：黄赭色链霉菌SN16原粉20%，海藻酸钠溶液（1 mg/mL）24%，CMC溶液（10 mg/mL）24%，硅藻土32%。添加这3种助剂后，黄赭色链霉菌SN16活体粉剂于4℃保存60 d后其生物量为2.45×108CFU/g，存活率达到24.90%，常温保存60 d后能达到0.94×108CFU/g。盆栽实验结果表明，1%浓度的黄赭色链霉菌SN16菌剂能够对小麦幼苗的株高、鲜重、株干重具有显著的促进作用，分别比对照组提高了9.85%、57.90%和66.67%。

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Development of Microbial Inoculum of Streptomyces silaceus and Its Effect on Wheat Seedling Growth

HE Wen1，2LIU Jin-long2KOU Juan-ni2TANG Zheng-shuai2LIU Li-ying2SUN Zhong-tao1，2
（1. Shandong Agricultural University，Quan Lin Humic Acid Fertilizer Engineering Laboratory，Tai’an 271018 ；2. College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018）

In order to improve the stability of microbial agents with Streptomyces silaceus SN16，the amounts of carriers，protectants and dispersants were optimized and the optimal formula of them was determined，and the influence of which on wheat seedling growth was studied by pot experiment. Results showed that the optimal formula of the microbial agent was Streptomyces SN16 20%，sodium alginate solution（1 mg/mL）24%，sodium carboxymethyl cellulose（CMC）solution（10 mg/mL）24%，and diatomaceous earth 32%. By this formula，the biomass of microbial inoculum was 2.45×108CFU/g while conserved at 4℃ and 0.94×108CFU/g at room temperature after 60 d. Pot experiment demonstrated that the plant height，fresh weight and dry weight of wheat seedlings applied with microbial agent of 1% Streptomyces silaceus SN16 increased by 9.85%，57.90% and 66.67% compared to the CK，respectively，which reached significant level（P＜0.05）. However，its promoting effect on root was insignificant（P＞0.05）. This research provides a new type of Streptomyces silaceus agent for agricultural production.

Streptomyces silaceus；microbial agents；additives；wheat；seedling growth

2017-05-17

山东农业大学泉林黄腐酸肥料工程实验室开放研发基金项目（QL2016-6），山东省科技重大专项（2015ZDXX0502B04），山东省农业重大应用技术创新项目（2015年）

何文，女，硕士研究生，研究方向：微生物工程；E- mail：wenhehw11@163.com

孙中涛，男，博士，研究方向：农业微生物工程，E-mail：zhtsun@sdau.edu.cn；刘丽英，女，博士，研究方向：农业微生物工程，E-mail：llylxy@163.com

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0402

（责任编辑 朱琳峰）