杉木遗传转化中抗生素种类和浓度的筛选

薛 爽，叶义全，2，饶丽莎，左丹丹，汪凤林，林思祖，2，许珊珊，2*

（1.福建农林大学林学院，福州 350002；2.国家林业局杉木工程技术研究中心，福州 350002）

杉木遗传转化中抗生素种类和浓度的筛选

薛 爽1，叶义全1，2，饶丽莎1，左丹丹1，汪凤林1，林思祖1，2，许珊珊1，2*

（1.福建农林大学林学院，福州 350002；2.国家林业局杉木工程技术研究中心，福州 350002）

【目的】筛选适用于农杆菌介导的杉木遗传转化的抗生素种类和浓度，为杉木遗传转化体系建立提供理论依据。【方法】以杉木组培苗茎段和嫩芽为材料，探讨了潮霉素、卡那霉素和头孢霉素对其生长的影响以及对农杆菌GV3101的抑菌效果。【结果】潮霉素浓度为40 mg/L和60 mg/L时，杉木嫩芽和茎段培养42 d存活率分别为8.78%、13.97%和7.05%、5.93%，表现出良好的效果；80 mg/L时，其生长完全被抑制。卡那霉素浓度为100 mg/L时，杉木嫩芽和茎段在80 d时存活率仍高达75.04%和80.37%。300 mg/L的抗生素抑菌剂头孢霉素能有效抑制农杆菌GV3101生长，且该浓度下杉木嫩芽及茎段增殖效果良好。【结论】在以杉木嫩芽和茎段为受体材料的遗传转化体系中，40～60 mg/L和60～80 mg/L的潮霉素可作为杉木遗传转化抗性苗二次筛选的选择压，300 mg/L头孢霉素可作为农杆菌GV3101的抑菌浓度。

杉木；遗传转化；抗生素；农杆菌

杉木（Cunninghamia lanceolata Hook）是我国南方最重要速生用材树种之一，因其具有材质优良和速生丰产等特点而被广泛种植[1]。据统计，目前杉木人工林栽植面积已达1 100多万hm2，木材产量占全国商品材产量的1/4，在保障我国物质安全、生态安全等方面具有重要作用[2]。然而，长期林业生产实践表明，杉木连栽导致林分生产力下降问题日益突出。引起杉木连栽产量下降的原因众多，其中铝毒害被认为是主要原因之一[3-4]。因而，利用基因工程手段改良杉木耐铝毒能力，增加酸性土壤上杉木产量，是实现杉木用材林可持续发展的当务之急。

转基因技术是获得改良的植物品种的主要途径，目前人们利用转基因手段已获得许多具有优良性状的转基因植物[5-7]。稳定的植物遗传转化体系的建立是获得转基因植株的前提。然而，在建立农杆菌介导的植物遗传转化体系中，筛选适合的抗生素种类和浓度是基因转化成败的关键，因为不同的受体材料对不同抗生素的敏感程度和毒害的忍耐程度存在较大差异[8]。因此，为取得较好的筛选效果，在转化之前有必要开展抗生素种类和浓度筛选试验。本研究分别以杉木组培苗茎段和嫩芽为研究对象，比较分析不同抗生素种类及浓度对杉木茎段和嫩芽生长的影响，以期确定在杉木遗传转化中这些抗生素的适宜筛选浓度，为杉木遗传转化体系的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试材料为国家林业局杉木工程技术研究中心保存的杉木组培苗105。取其顶部茎段（切去茎尖）及新萌发的嫩芽用于杉木遗传转化中抗生素种类和浓度筛选。

1.2 方法

1.2.1 抗生素下杉木组培苗茎段及嫩芽生长试验

杉木组培苗105的顶部茎段（用手术刀片切去茎尖）及新萌发的嫩芽分别接种于含不同浓度的潮霉素（0、10、20、40、60、80、100 mg/L）、卡那霉素（0、3、5、7、9、50、100 mg/L）及头孢霉素（0、50、100、150、200、250、300 mg/L）的诱导培养基MS+0.3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+3%蔗糖，pH5.8。每个处理接种10瓶，每瓶接种4株，3次重复。培养条件为光照12 h/d、光强1 800 Lx、培养温度（25±2）℃。接种后，分别在35、42和80 d统计死亡率和枯萎率。死亡率=死亡株数/（接种总株数-污染株数）×100%；枯萎率=枯萎株数/（接种总株数-污染株数）×100%。

1.2.2 头孢霉素对农杆菌GV3101的抑菌试验

取15 μL活化过的农杆菌GV3101菌液，在含50 mg/L利福平和300 mg/L头孢霉素的YEB平板上划菌，共进行3次平行试验，每次划20个平板，共60个平板，于28℃的环境中倒扣培养48 h，观察农杆菌生长情况。

2 结果与分析

2.1 不同潮霉素浓度对杉木嫩芽和茎段生长的影响

由表1可知，随着潮霉素浓度的增加，杉木嫩芽及茎段的存活率均逐渐降低。从表2可知，在培养35 d时，一定的潮霉素浓度范围内（0～60 mg/L），嫩芽和茎段的存活率差异并不明显，而当潮霉素浓度高于60 mg/L时，茎段存活率显著低于嫩芽，特别是当潮霉素浓度为100 mg/L时，嫩芽和茎段存活率均达到最低值分别为50.25%和16.14%。继续培养至42 d，各潮霉素浓度下嫩芽和茎段存活率均进一步降低。其中当潮霉素为40 mg/L时，嫩芽及茎段存活率仅为8.78%和13.97%；当潮霉素浓度继续增至60 mg/L时，嫩芽及茎段存活率则继续降至7.05%和5.93%，直至潮霉素浓度为80 mg/L时，杉木嫩芽及茎段的生长完全被抑制。由此可见，杉木不同部位材料对潮霉素浓度的敏感性和毒害的耐受性存在一定的差异。同时，通过观察我们还发现在培养前35 d对杉木嫩芽及茎段生长的影响效果并不理想，当培养至42 d时，其对杉木嫩芽及茎段生长的影响效果显著。由于过高浓度会使杉木嫩芽和茎段生长完全受抑，影响转化，而低浓度又会增加假阳性概率。因此，利用杉木组培苗105嫩芽和茎段作为受体材料进行二次筛选过程中，40～60 mg/L和60～80 mg/L的潮霉素可分别作为第一次和第二次筛选的适宜浓度，42 d可作为杉木转化苗筛选时间。

2.2 不同卡那霉素浓度对杉木嫩芽和茎段生长的影响

转化植株在含有卡那霉素培养基上的生长情况是筛选与检测目的基因转化成功与否的重要依据。通过分析不同浓度的卡那霉素对杉木嫩芽和茎段存活率的影响，结果表明（表3），随着卡那浓度的增加，杉木嫩芽和茎段的存活率逐渐下降。方差分析结果显示不同浓度卡那霉素对杉木嫩芽和茎段生长的影响存在极显著差异（表4）。同时研究还发现在低浓度（＜10 mg/L）条件下杉木嫩芽和茎段对卡那霉素的反应比潮霉素敏感，卡那浓度为9 mg/L时，培养35 d的杉木嫩芽及茎段存活率仅分别为84.38%和86.24%，低于10mg/L浓度下潮霉素的存活率（95.3%和90.66%）；而当卡那霉素浓度增加到100 mg/L时，杉木嫩芽及茎段存活率仍达到75.04%和80.37%，远高于同浓度下潮霉素的存活率（50.25%和16.14%）；继续延长培养至80 d杉木嫩芽和茎段存活率仍为75.04%和80.37%，而在同浓度的潮霉素下杉木嫩芽和茎段的存活率在42 d时就已为0%，表明杉木嫩芽和茎段对高浓度卡那霉素比较耐受，其反应较为迟钝。因此，卡那霉素不适宜作为遗传转化过程中有效的抗生素筛选剂。此外，研究还表明不同培养天数对嫩芽和茎段存活率没有影响，该结果间接证实相对于潮霉素而言，卡那霉素对杉木嫩芽和茎段生长的影响较小，不适宜作为抗生素筛选剂。

表1 不同潮霉素浓度对杉木嫩芽及茎段生长的影响Table 1 Effects of different concentrations of hygromycin on the growth of shoots and stems of C.lanceolata

表2 不同潮霉素浓度下杉木嫩芽及茎段存活率的方差分析Table 2 The variance analysis of the survival rate in shoots and stems of C.lanceolata under different concentrations of hygromycin

2.3 头孢霉素对杉木嫩芽和茎段生长的影响

在遗传转化过程中，选择既不影响受体材料生长又可有效抑制农杆菌生长的抑菌剂浓度是获得较高遗传转化效率的关键。因此，本试验分析了不同头孢霉素浓度对杉木嫩芽及茎段生长的影响。结果表明（表5），与潮霉素和卡那霉素相比，头孢霉素对杉木嫩芽和茎段生长的影响相对较小。随着头孢霉素浓度的增加杉木嫩芽和茎段的存活率逐渐上升，当头孢霉素浓度达300 mg/L时，杉木嫩芽及茎段的存活率均为最高，分别为97.92%和100.00%。与卡那霉素类似，头孢霉素对不同培养天数下杉木嫩芽和茎段存活率没有影响。对不同浓度头孢霉素的存活率进行差异显著性检验（表6）结果表明，不同浓度头孢霉素对杉木嫩芽存活率存在显著影响，而对杉木茎段存活率的影响并不显著。此外，在试验过程中发现，当头孢霉素浓度为100～200 mg/L时，杉木嫩芽及茎段出现基部膨大现象，且新长出的杉木苗矮小并有白化现象[图 1（a）、图 1（b）、图 1（e）、图 1（f）]；当头孢霉素浓度继续增加到250～300 mg/L时，杉木嫩芽及茎段增殖效果良好，且新长出的杉木苗呈深绿色，长势良好[图 1（c）、图 1（d）、图 1（g）、图 1（h）]。因此，可选择300 mg/L的头孢霉素继续分析其对农杆菌的抑菌效果，进而确定其是否可以作为杉木遗传转化过程中头孢霉素的抑菌浓度。

表3 不同卡那浓度对杉木嫩芽及茎段生长的影响Table 3 Effects of different concentrations of kanamycin on the growth of shoots and stems of C.lanceolata

表4 不同卡那浓度下杉木嫩芽及茎段存活率的方差分析Table 4 The variance analysis of the survival rate in shoots and stems of C.lanceolata under different concentrations of kanamycin

2.4 头孢霉素对农杆菌GV30101的抑菌试验

在确定300 mg/L的头孢霉素对杉木嫩芽及茎段生长影响较小，且长势良好后，将活化过的农杆菌GV3101在含50 mg/L利福平和300 mg/L头孢霉素的YEB平板进行划菌，28℃下培养48 h后，发现农杆菌GV3101的生长完全被抑制。因此，在杉木遗传转化过程中，300 mg/L头孢霉素可作为农杆菌GV3101的抑菌浓度。

3 讨论

在植物遗传转化过程中，一般要求选择抗生素的种类和浓度既要能有效抑制非转化细胞的生长，又不影响转化细胞的正常生长[9]。由于不同受体材料对不同种类和浓度的抗生素敏感程度和毒害的耐受程度存在较大差异，确定适宜的选择抗生素种类和浓度对获得转基因植株至关重要。抗生素的选择与遗传转化中所用载体所带抗性基因密切相关，潮霉素和卡那霉素是遗传转化常用的抗生素标记基因，研究表明潮霉素是一种很好的选择抗生素，对未转化材料的影响效果显著[10]。李文兰等[11]报道，罗汉果子叶不定芽分化的潮霉素选择压为25 mg/L，葡萄风信子胚性愈伤组织的潮霉素选择压为90 mg/L[12]。可见，不同受体材料对潮霉素的敏感性差异较大。本试验发现，40 mg/L的潮霉素培养42 d时，杉木嫩芽及茎段存活率仅为8.78%和13.97%；当潮霉素浓度继续增至60 mg/L和80 mg/L时，杉木嫩芽及茎段存活率持续下降，直至其生长完全被抑制。因此，可将40～60 mg/L和60～80 mg/L的潮霉素分别作为杉木遗传转化过程中转化苗第一次和第二次筛选的选择压。

表5 不同头孢霉素浓度对杉木嫩芽及茎段生长的影响Table 5 Effects of different concentrations of cephalosporin on the growth of shoots and stems of C.lanceolata

表6 不同头孢霉素浓度下杉木嫩芽及茎段存活率的方差分析Table 6 The variance analysis of the survival rate in shoots and stems of C.lanceolata under different concentrations of cephalosporin

卡那霉素作为另一种常用的选择抗生素，其浓度范围也常因受体材料的品种、部位的不同而有所不同。席梦利等[13]研究发现低浓度的卡那霉素对杉木茎段芽的诱导产生显著影响，8 mg/L卡那霉素完全抑制杉木芽生根。本试验发现当卡那浓度为100 mg/L时，对杉木嫩芽和茎段生长的影响还比较小，不适宜作为杉木遗传转化苗的抗性筛选，与席梦利的研究结果相反，可能与所用的杉木品种不同有关。

在农杆菌介导的遗传转化过程中，头孢霉素常用作抑菌剂，用来抑制农杆菌的大量繁殖，同时还应保证不影响植物正常生长。因此，选择适宜的头孢霉素浓度至关重要。本试验研究结果表明，300 mg/L的头孢霉素能有效抑制农杆菌GV3101生长，且在该浓度下杉木嫩芽及茎段增殖效果良好，新长出的杉木苗呈深绿色，长势良好。因此，300 mg/L头孢霉素可作为杉木遗传转化过程中农杆菌GV3101的抑菌浓度。此外，值得注意的是相对于高浓度头（孢霉素（250 mg/L和300 g/L）而言，低浓度头孢霉素（50 mg/L）显著降低茎段和嫩芽存活率（表5），这可能是外植体在适应一定浓度范围头孢霉素时表现出的一种正常波动现象。同样在华北绣线菊再生及遗传转化体系建立过程中，张娇等[14]也发现当头孢浓度为50 mg/L时其愈伤分化率为40%，随着浓度的升高，愈伤分化率逐渐上升并在150 mg/L时达到峰值（53%），当头孢浓度继续增加，其分化率则呈不可逆的直线下降趋势，直到分化率为0%。类似地，在不同抑菌抗生素对莫利莎葡萄叶片离体再生[15]及盐稻8号愈伤组织分化[16]的影响研究中也有发现这种波动现象，由此可见，在抑菌抗生素浓度达到特定阈值前，其对植物生长的影响表现出一定的波动，当其浓度超过特定阈值后对植物生长才表现出不可逆的显著抑制作用，而导致这种在一定抑菌抗生素浓度范围内植物生长呈波动现象的潜在原因有待进一步研究。

本文对潮霉素、卡那霉素作为杉木转化苗的筛选试剂及头孢霉素作为农杆菌GV3101的抑菌剂进行研究，可为杉木遗传转化过程中提高筛选和鉴定转基因植株提供一定的理论依据。在后续的研究过程中，我们将会在此基础上进一步对杉木的遗传转化效率进行分析。

图1 头孢霉素浓度对杉木嫩芽及茎段生长的影响Figure 1 Effects of different concentration of cephalosporins on the growth of shoots and stems of C.lanceolata

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Selection of Antibiotic Species and Concentration in Genetic Transformation of Cunninghamia lanceolata Hook

XUEShuang1，YEYi-quan1，2，RAOLi-sha1，ZUODan-dan1，WANGFeng-lin1，LINSi-zu1，2，XUShan-shan1，2*
（1.College of Forestry，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China；2.State Forestry Administration Engineering Research Center of Chinese Fir，Fuzhou 350002，China）

【Objective】The aim of this study was to explore suitable species and concentrations of antibiotics for Cunninghamia lanceolata during the establishment of agrobacterium-mediated genetic transformation system，and to provide a theoretical basis for construction of genetic transformation system of C.lanceolata.【Method】The effects of three different antibiotics(cephalosporin，hygromycin and kanamycin)on stem and shoot growth of tissue-culture seedlings of C.lanceolata and their antibacterial responses to GV3101 were investigated.【Results】When the concentrations of hygromycin were 40 mg/L and 60 mg/L，the survival rates of shoots and stems on 42 days were 8.78%，13.97%，7.05%and 5.93%，respectively.Their growths were totally inhibited when hygromycin concentration was 100 mg/L.In addition，the survival rates of shoots and stems on 80 days were 75.04%and 80.37%，respectively，when kanamycin concentration of was 100 mg/L.300 mg/L antibacterial agent of cephalosporin effectively inhibited the growth of GV3101，and the proliferation of shoots and stems were the best under this concentration.【Conclusion】Taken together，in the transgenic transformation system that shoots and stems of C.lanceolata wereusedasacceptormaterials，40～60mg/Land60～80mg/Lofhygromycinconcentrationcouldbe used as a selection pressure for second screening of resistance seedlings of C.lanceolata and 300 mg/L cephalosporin could be used as an optimal antibacterial concentration for agrobacterium GV3101.

Cunninghamia lanceolata Hook；genetic transformation；antibiotics；agrobacterium

S791.27 文献标志码：A 文章编号：1000-2650（2017）02-0227-07

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.02.014

2017-02-24

中央财政支持地方专项（6213c0111）。

薛爽，硕士生。*责任作者：许珊珊，硕士，研究实习员，主要从事林木遗传育种研究，shi_xu_1987@163.com。。

（本文审稿：张 健；责任编辑：巩艳红；英文编辑：徐振锋）