广西汉族人群MTHFR和MTRR基因多态性与深静脉血栓的研究

胡长付 ，王行海，刘起理 ，郭建刚 ，唐前辉，王泽

(1.桂林医学院附属医院血管外科，广西 桂林 541000；2.北京石景山医院血管外科，北京 100041)

2017年，我国共有2.9亿心血管病患者，心脑血管住院费用将超过705亿元，平均每5名中国成人就有1例心血管病患者。 城乡居民疾病死亡构成比中，心血管疾病占首位，心脑血管疾病已经成为我国公共卫生领域，尤其是慢病防控领域的最大挑战。今年5月，首份科学、客观评估中国人群心血管健康状况《中国心血管健康指数(2017)》正式发布，报告指出把握心血管防控的重要因素包括：预防心血管疾病，减少吸烟、肥胖、污染等危险因素暴露，提高血压、血脂、血糖筛查，提高公共卫生政策与服务能力，提高医疗救治能力。同时，还需要来自社会(百姓认知、大众媒体、公共设施)和政府(财政投入、政策保障)的共同支持。

2017年的心血管治疗领域取得了诸多可能改写指南的研究结论。在稳定性冠心病治疗策略上，COMPASS研究显示，对于稳定性动脉粥样硬化性血管疾病患者，应用超低剂量利伐沙班联合阿司匹林治疗，尽管出血风险有所增加，但仍可产生显著心脑血管获益；FAME 2研究结果证实，成本效益相当的情况下，对于稳定性冠心病患者，冠状动脉血流储备分数(FFR)指导下行经皮冠状动脉介入治疗(PCI)可显著改善患者预后，减少不良事件发生。在ST段抬高的急性心肌梗死(STEMI)患者，DAPT STEMI研究显示，在考虑了安全性、有效性和出血风险后，应用新一代药物洗脱支架直接PCI的无事件的STEMI患者双联抗血小板药物(DAPT)治疗6个月不低于12个月； CAMPARE-ACUTE研究提出，STEMI患者行PCI后同期行完全血运重建安全可行，采用FFR指导的同期处理非罪犯血管，不良事件发生率更低。对于生物可降解支架的获益可能并不体现在完全降解之前的短时间内，需要长期的随访结果。在血脂领域，FOURIER研究是关于PCSK9抑制剂的第一项临床终点研究，新型降脂药物PCSK9抑制剂降低胆固醇幅度与心血管保护作用的关系与他汀类药物几近完全一致。但是，对于PCSK9抑制剂的安全性问题、个体化差异以及长期治疗的持续获益问题，仍需进一步的研究证实。房颤治疗方面， PREVAIL研究结果表明，左心耳封堵对非瓣膜性房颤患者的卒中预防与口服抗凝药疗效相当，除了明显减少大出血，特别是出血性卒中，左心耳封堵组致残或致死事件也少于华法林组。因此，对于那些无法长期口服抗凝药的患者，左心耳封堵可以作为非瓣膜性房颤患者卒中预防的一种合理策略；RE-DUAL PCI研究显示，相比于经典的三联抗栓治疗，达比加群联合一种P2Y12抑制剂的双联抗栓治疗策略可有效降低出血风险，同时不增加血栓风险，显示了双联疗法的临床净获益。在抗血小板和抗凝联合方案中，新型抗凝药物是一个更优的选择。因此，如何将不断涌现的新观点、新理念、新技术与我国国情相结合，加速推动我国心脑血管疾病事件“拐点”早日到来，是每一位心血管医生的责任与使命。

本期栏目就血栓形成及纤溶、心衰与心绞痛的治疗、糖尿病与心功能等心血管热点问题进行了探讨，对心血管疾病的防治提供了有益的参考。

心血管疾病研究专题栏目策划专家杨颖博士简介

杨颖，心血管内科专业博士，副教授，硕士研究生导师。2000年毕业于川北医学院临床医学系，2007年、2013年先后在华中科技大学同济医学院获得硕士、博士学位。2013年至2015年在四川大学华西医院临床医学博士后流动站工作。现为四川省医学会心血管病专业委员会委员、四川省康复医学会心血管专业委员会委员、第十二批四川省卫生计生委学术技术带头人后备人选。主要从事心血管疾病的临床诊治工作，研究领域为动脉粥样硬化的流行病学及发病机制。近年来，主持国家自然科学青年基金项目1项及其他10余项国家级及省厅级科研项目，公开发表学术论文20余篇。

广西汉族人群MTHFR和MTRR基因多态性与深静脉血栓的研究

胡长付1，王行海1，刘起理1，郭建刚1，唐前辉1，王泽2

(1.桂林医学院附属医院血管外科，广西 桂林 541000；2.北京石景山医院血管外科，北京 100041)

目的研究广西汉族人群MTHFR、MTRR基因多态性与深静脉血栓的关系，为临床防治提供参考。方法选取90例广西汉族下肢深静脉血栓患者作为研究组，另选取同期接受健康体检的90例广西汉族正常人员作为对照组，通过等位基因序列的特异性引物相关聚合酶链反应多态性技术对两组人员的MTHFR、MTRR基因多态性进行分析，进而对两组人员的基因型、等位基因相关分布频率进行比较。结果研究组患者的MTHFR基因677位点的CC、TT、CT基因型及等位基因C、T的分布频率分别是41.1%、32.2%、26.7%、54.4%、45.6%，与对照组的55.6%、18.9%、25.5%、70.6%、29.4%比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而研究组人员的MTRR基因66位点AA、GG、AG基因型及等位基因A、G分布频率分别是56.7%、18.9%、24.4%、68.9%、31.1%，与对照组的48.9%、14.4%、36.7%、66.7%、33.3%比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论广西汉族人群的深静脉血栓形成可能与MTHFR基因677位点的TT基因多态性存在相关性，而MTRR基因多态性与深静脉血栓发生可能无相关性。

广西汉族人群；亚甲基四氢叶酸还原酶；MTRR基因多态性；深静脉血栓；相关性

深静脉血栓是一种常见的多发性下肢静脉回流障碍性疾病，血流缓慢及静脉壁受损、血液高凝状态时引起深静脉血栓三大致病因素，若患者不及时接受有效诊断、治疗，多数患者病情恶化成血栓形成后遗症，对患者生活质量造成长期严重影响；部分患者易并发肺栓塞，危害患者健康及生命安全[1-2]。近年来，随着医学对深静脉血栓形成危险因素的深入研究发现，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性、MTRR基因多态性可能与深静脉血栓形成存在相关性[3]；若MTHFR、MTRR基因多态性发生异常，易造成同型半胱氨酸堆积，并产生高Hcys血症，增高血浆Hcys水平，导致Hcys与金属离子作用下进行自身氧化并形成氧自由基、过氧化物，破坏内皮细胞功能、结构，增加内皮素-1释放，减少血管内皮衍生松弛因子、前列腺素释放，造成血管舒缩因子相关平衡紊乱，进而形成血栓[4]。基于此，本研究对广西汉族人群MTHFR和MTRR基因多态性与深静脉血栓形成相关性进行分析，为临床防治提供参考。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年6月至2016年6月在桂林医学院附属医院接受诊治的90例广西汉族下肢深静脉血栓患者作为研究组，所有患者均经下肢深静脉造影、彩超等相关检查确诊为下肢深静脉血栓；无精神疾病、意识障碍；无血液系统疾病、急性心肌梗死、肝肾功能不全、急性脑血管事件、恶性肿瘤等情况；排除近期手术史及外伤史；排除妊娠期、哺乳期女性。其中男性49例，女性41例，年龄30～75岁，平均(48.6±10.3)岁。另选取同期来本院接受健康体检的90名广西汉族正常人员作为对照组，排除下肢深静脉血栓症病史，经体格检查、询问病史及实验室检查等相关检查显示无异常，无心脑血管疾病[5]；其中男性47名，女性43名，年龄28～75岁，平均(48.3±10.9)岁。两组在年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA 两组人员均在空腹状态下抽取3 mL静脉血，经EDTA-k2抗凝过程后，取淋巴细胞分离液进行分离操作，提取DNA基因组，采用紫外分光光度计对DNA含量进行测量，置于冰箱(-20 ℃)环境下保存。

1.2.2 设计引物 提取等位基因，参考NCBI基因库相关序列，通过Vector NTI 9.0软件进行序列设计。①MTHFR：设计上游引物1为：5′-GAGAAGGTGTCT-GCGGGAGC-3′，与上游引物2为：5′-GGAGAAGGT-GTCTGCGGGAGT-3′；而下游引物为：5-CGCTGTG-CAAGTTCTGGACC-3′。②MTRR：设计上游：5′-TTTCATTATCGTTTCCACCG-3′，设计下游1：5′-GTACCACAGCTTGCCTCACAT-3′，设计下游2：5′-GTACCACAGCTTGCTCACAC-3′。

1.2.3 制定序列引物聚合酶链反应 ①建立PCR体系：反应体系内含1 L 10×PCR缓冲液、0.5 L 10 pmol/L引物混合物、0.5 L 1U DNA聚合酶以及1 L 200 mol dNTP，并用10 L灭菌水补足[6]。②PCR的反应条件：于PCR仪上进行5 min的95 ℃预变性，根据30 s(95 ℃)、50 s(63 ℃)、30 s(72 ℃)进行30个循环，后4 ℃恒温[7-8]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 基因型分析

MTHFR基因的第677位点多态性相关突变位点是rs1801133，而PCR产物片段的大小是277 bp，具体基因型表现为CC型、TT型、CT型，见图1；MTRR基因的66位点多态性相关突变位点是rs1801394，而PCR扩增产物的片段大小是1 050 bp，期基因型表现为AA型、GG型、AG型，见图2。

2.2 MTHFR、MTRR携带频率

研究组人员基因型TT及等位基因C、T的分布频率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组人员的基因型CC、CT分布频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；两组人员MTRR基因的66位点A/G携带频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、表2，图3及图4。

表1两组人员MTHFR基因的第677位点C/T携带频率情况[n(%)]

组别基因型频率分布CCTTCT等位基因频率分布CT对照组(n=90)50(55．6)17(18．9)23(25．5)127(70．6)53(29．4)研究组(n=90)37(41．1)29(32．2)24(26．7)98(54．4)82(45．6)χ2值3．7604．2050．0299．9679．967P值0．0530．0400．8650．0020．002

表2两组人员MTRR基因的66位点A/G携带频率情况[n(%)]

组别基因型频率分布AAGGAG等位基因频率分布AG对照组(n=90)44(48．9)13(14．4)33(36．7)120(66．7)60(33．3)研究组(n=90)51(56．7)17(18．9)22(24．4)124(68．9)56(31．1)χ2值1．0920．6403．1680．2040．204P值0．2960．4240．0750．6520．652

3 讨论

深静脉血栓属于常见临床病症，多受骨折外伤、遗传、口服避孕药及手术等相关外在因素影响，其中最为显著的是遗传因素，相关研究发现深静脉血栓发生、发展过程中具有多种风险因子[9]。近年来，随着临床医学深入研究深静脉血栓发现，凝血因子VG16912A基因多态性及MTHFR基因C677T多态性、凝血酶原基因G20210A多态性和印度人、白种人的深静脉血栓形成有关[10]；且MTHFR基因C677T多态性、MTRR基因A66G凝固可增加儿童同型半胱氨酸、叶酸表达[11]。

目前，临床医学检测基因多态性方法较多，常规分析基因多态性多以限制性的片段长度多态性、聚合酶链反应寡核苷酸探针杂交PCR-SSO法及聚合酶链反应单链构象多态性法等为主，PCR-RFLP能特异性的对酶切片段进行扩增，但其酶切图谱较为复杂[12]；而PCR-SSO具有较高的分辨率，但使用的探针较为昂贵，且临床操作繁琐。PCR-SSP通过模板DNA进行设计，若3′端的碱基无法互补易导致Taq酶延伸作用因3′，若5′-磷酸二酯键的形成障碍出现受阻，通过凝胶电泳对HLA等位基因型进行检测扩增分析[13]。研究表明，和PCR-SSP比较，上述相关方法对操作技术的要求较高，且临床操作较为复杂，检测费用昂贵，分型检测所需时间长，难以在实验室进行广泛开展与应用。PCR-SSP法存在高分辨率、强特异性，临床操作简便及快速，便于推广应用，故本研究应用PCR-SSP法对MTHFR、MTRR基因多态性进行检测分析[14-15]。

研究表明，MTHFR缺陷易造成Hcys转化成蛋氨酸出现障碍，使Hcys堆积于血液内，引发同性半胱氨酸血症；而血浆内Hcys表达增加，能导致Hcys于金属离子的介导作用下进行自身氧化形成或氧化物、氧自由基，对人体内皮细胞结构、功能造成损害，而血管内皮细胞受损后，能增加内皮素-1释放，降低前列腺素、内皮衍生松弛因子释放，扰乱血管舒缩因子相关平衡，进而促使血栓形成，引发心血管疾病[16]。相关研究发现，人体缺乏叶酸、高同型半胱氨酸血症为血栓栓塞发生独立危险因素；故分析MTHFR基因突变多为引起叶酸表达减少的一种遗传因素，由此提示MTHFR基因C677T多态性分布存在一定复杂性，可能与民族、人种、地理及地域等相关因素共同影响有关[17]。MTRR基因主要定位在染色体5p15.2～15.3，而人类编码序列包含2094碱基对，四氢叶酸水平及保持合理的Hcys浓度具有重要作用；若MTRR出现变异，易导致血浆内Hcys浓度增高[18-19]。研究发现，MTRR基因66A-G多态性能造成叶酸代谢异常，引发高同型半胱氨酸血症，损伤血管内皮组织，进而刺激血管平滑肌细胞，造成血管舒缩因子相关平衡受损，进而形成深静脉血栓，但有待进一步研究[20]。本研究结果显示，研究组人员MTHFR基因型分布频率、等位基因分布频率与对照组比较存在差异，但两组人员的MTRR基因多态性分析无明显差异；提示广西汉族人群的深静脉血栓形成可能与MTHFR基因677位点的TT基因多态性存在相关性，而与MTRR基因多态性可能无相关性，分析原因可能与选取样本量能较少有关，后面可增加样本量进行深入性研究。

综上所述，MTHFR基因677位点的TT基因多态性可能与广西汉族人群的深静脉血栓形成存在相关性，故TT基因型可能为引发深静脉血栓的独立性危险因子，而MTRR基因多态性与深静脉血栓发生可能无相关性。

[1] 胡兴文，王维鹏.MTFHR基因两位点多态性及其与MTRR基因多态性的关系分析[J].中国妇幼保健，2015，30(25)：4336-4339.

[2] 杜培泽，孙海波，孙聪毅，等.下肢深静脉血栓形成多种因素的临床分析和研究[J].重庆医学，2015，44(9)：1265-1267.

[3] 宋枬.凝血因子Ⅺ及其基因多态性与深静脉血栓形成关系的研究进展[J].中华骨科杂志，2016，36(10)：634-639.

[4] El Sebay HM,Safan MA,Daoud AA,etal.Association of factor V Leiden,Janus kinase 2,prothrombin, and MTHFR mutations with primary Budd-Chiari syndrome in Egyptian patients[J].J Gastroenterol Hepatol,2016,31(1):235-240.

[5] 张玲玲，于剑，王坤，等.下肢深静脉血栓形成相关危险因素分析[J].中国现代普通外科进展，2016，19(12)：955-956，989.

[6] 王阳，陈建立，陈俊卯，等.中国人群 MTHFR C677T基因多态性与静脉血栓症相关性的Meta分析[J].实用药物与临床，2017，20(9)：1004-1008.

[7] 陈磊，常荣.亚甲基四氢叶酸还原酶C677T 基因多态性的研究进展[J].中国循证心血管医学杂志，2016，8(1)：113-115.

[8] 郑永红，陈群，朱德晓，等.血浆同型半胱胺酸水平和5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与原发性下肢深静脉血栓形成的相关性研究[J].中国循环杂志，2014，29(3)：209-212.

[9] 郭辰虹，郭琼行，龚瑶琴，等.亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T突变与山东汉族人群深静脉血栓形成的相关性[J].中华医学遗传学杂志，2002，19(4)：295-297.

[10] Zhang P,Gao X,Zhang Y,etal.Association between MTHFR C677T polymorphism and venous thromboembolism risk in the Chinese population:a meta-analysis of 24 case-controlled studies[J].Angiology,2015,66(5):422-432.

[11] 郑红，贺颖，陈辉，等.凝血因子基因突变及 MTHFR /C677T基因多态性与深静脉血栓形成的关系[J].中华血液学杂志，2006，27(3)：197-198.

[12] 斯琴高娃，杨敬平.MTHFR基因多态性与肺血栓栓塞症的关系[J].临床肺科杂志，2015， 20(11)：2086-2093.

[13] 陈钊，何深文，李旺英.MTHFR 基因 C667T 多态性与动脉血栓性脑梗死的关联性研究[J].中国现代医生，2013，51(17)：32-34.

[14] 郑永红，陈群，朱德晓，等.血浆同型半胱胺酸水平和5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与原发性下肢深静脉血栓形成的相关性研究[J].中国循环杂志，2014，29(3)：209-212.

[15] 宋秀婷，齐文彦，王颖，等.MTHFR C677T 基因多态性与深静脉血栓危险性 Meta 分析[J].河南科技大学学报，2016，36(3)：209-215.

[16] 陈银河，刘晓敏.亚甲基四氢叶酸还原酶 C677T 单核苷酸多态性与腹腔静脉血栓易感性关系的 Meta 分析[J].中国普通外科杂志，2016，25(12)：1757-1765.

[17] Zhou TB,Drummen GP,Jiang ZP,etal.Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T gene polymorphism and diabetic nephropathy susceptibility in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Ren Fail,2015,37(8):1247-1259.

[18] 陈银河，刘晓敏.亚甲基四氢叶酸还原酶C677T单核苷酸多态性与腹腔静脉血栓易感性关系的Meta分析[J].中国普通外科杂志，2016，25(12)：1757-1765.

[19] 凯丽比努尔·阿布都热合曼，艾力曼·马合木提，夏玉宁，等.MTHFR基因多态性及同型半胱氨酸与维吾尔族人群静脉血栓栓塞症的相关性研究[J].新疆医科大学学报，2014，37(2)：142-146.

[20] 张再伟，田红燕，赵亚玲，等.中国人MTHFR C677T基因多态性与静脉血栓症相关性研究[J].西安交通大学学报，2013，34(6)：818-821，825.

StudyonMTHFRandMTRRgenepolymorphismanddeepvenousthrombosisinGuangxiHanpopulation

HU Chang-fu1,WANG Xing-hai1,LIU Qi-li1,GUO Jian-gang1,TANG Qian-hui1,WANG Ze2

(DepartmentofVascularSurgery,1.AffiliatedHospitalofGuilinMedicalCollege，Guilin541000,Guangxi;2.BeijingShijingshanHospital,Beijing100041,China)

Objective：To study the relationship between MTHFR and MTRR gene polymorphism and deep vein thrombosis in Guangxi Han population,and to provide reference for clinical prevention and treatment.Methods90 cases of patients with deep vein thrombosis of the lower limbs of Guangxi were selected as the study group.In the same period, 90 cases of normal Chinese people in Guangxi were selected as the control group.The MTHFR and MTRR gene polymorphisms of the two groups were analyzed by the specific primer-related polymerase chain reaction polymorphism (PCR),to compare the genotype and allele-related distribution frequency data of the two groups of researchers.ResultsThe frequency of CC,TT,CT genotype and allele C and T of the MTHFR gene in the study group were 41.1%,32.2%,26.7%,54.4% and 45.6%,respectively,compared with 55.6%,18.9%,25.5%,70.6% and 29.4% of the control group (P<0.05).The frequencies of AA,GG,AG genotype and allele A and G were 56.7%,18.9%,24.4%,68.9% and 31.1%,respectively,compared with 48.9%,14.4%,36.7%,66.7% and 33.3% of the control group (P>0.05).ConclusionThe deep vein thrombosis of the Han population in Guangxi may be related to the TT gene polymorphism of the 677 locus of the MTHFR gene,and the MTRR gene polymorphism may not correlate with the occurrence of deep vein thrombosis.

Guangxi Han population;MTHFR;MTRR gene polymorphism;Deep vein thrombosis;Relativity

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.06.001

广西省桂林市科学研究与技术开发计划项目(20150206-1-9)

2017-07-25

胡长付(1976-)，男，博士，副主任医师。E-mail：Huhu661000@163.com

时间： 2017-12-27 16∶44网络出版地址http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20171227.1643.002.html

1005-3697(2017)06-0812-04

R394.3

A

(学术编辑：冯超)