病毒性出血性败血症病毒N基因的病毒样颗粒制备及定值

王 群，姜 帆，岳志芹，孙 涛，郑小龙，张晓文，房保海

（山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东青岛 266002）

病毒性出血性败血症病毒N基因的病毒样颗粒制备及定值

王 群，姜 帆，岳志芹，孙 涛，郑小龙，张晓文，房保海

（山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，山东青岛 266002）

为制备含有病毒性出血性败血症病毒（VHSV）N基因的RNA病毒样颗粒标准样品，通过RT-RCR扩增VHSV的N基因，将其克隆至含有组氨酸标签的pNH-MS2his载体中，构建重组原核表达载体pNHMS2his-N；将重组质粒pNH-MS2his-N转化至表达菌株BL21（DE3），用1 mmol/L IPTG诱导表达、纯化；对病毒样颗粒进行鉴定及稳定性试验，使用数字PCR对病毒样颗粒进行定值。结果显示，该病毒样颗粒含VHSV N基因序列，并且稳定性良好，定值结果为8×106copies/mL。结果表明，构建的病毒样颗粒可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品使用。

病毒性出血性败血症病毒；病毒样颗粒；N基因；数字PCR

病毒性出血性败血症病毒（Viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV）是鱼类弹状病毒（Fish rhabdovirus）的一种，能引起鱼类急性或慢性内脏性疾病，导致的死亡率非常高[1-2]。该病毒流行区域广泛，在欧洲、美洲，以及亚洲的日本均有流行的报道[3]。该病毒宿主范围较大，可感染淡水和海水鱼类。目前VHSV的标准检测方法是先用细胞分离病毒，再通过免疫学（间接免疫荧光或酶联免疫吸附试验）或分子生物学（逆转录聚合酶链式反应）手段进行病原鉴定[4]。最近有研究显示，荧光PCR技术同细胞分离鉴定技术具有相似的敏感性和特异性[5-6]。

虽然荧光PCR技术具有灵敏、快速、易操作等特点，但为了确保准确性，在试验过程中需要设立阳性对照或质控品。为了便于荧光PCR方法的使用及推广，本研究制备了一种含有VHSV N基因的病毒样颗粒，将其作为试验中的阳性质控。该病毒样颗粒既有耐核糖核酸酶降解的优点，还可以帮助实现监控病毒提取过程的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

含有组氨酸标签的假病毒表达载体pNHMS2his：本实验室保存；病毒性出血性败血症病毒（VHSV）：深圳出入境检验检疫局技术中心惠赠。E.coli DH5a、BL21（DE3）：购自Tiangen；Ex Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒：购自宝生物工程（大连）有限公司；OneStep RT-PCR Kit、RNeasy Mini Kit、Ni-NTA Fast Start Kit：购自QIAGEN；AgPATH-ID One-Step RT-PCR Kit：购自 Ambion。

1.2 VHSV-N蛋白基因的扩增

按照文献报道的VHSV N蛋白基因核苷酸序列，设计的克隆引物、检测及定值时荧光定量RTPCR的引物及探针如下：

克隆引物：

NF：5´-CAA GCT TGC ATG CCT GCA GGT CGA C-3´

NR：5´-GCG GCC GCT CTA GAG ATT GTG TTT A-3´

检测及定值引物探针[4]：

VHSV P1：5´-AAA-CTC-GCA-GGA-TGTGTG-CGT-CC-3´

VHSV P2：5´-TCT-GCG-ATC-TCA-GTCAGG-ATG-AA-3´

VHSV Probe：5´-FAM-TAG-AGG-GCC-TTGGTGATC-TTC-TG-TAMRA-3´

按RNA 提取试剂盒说明书提取VHSV总RNA，然后将其作为模板，扩增N蛋白基因。RTPCR体系：5×RT-PCR缓冲液5 μL、dNTP 混合液 1 μL、反应酶混合液 1 μL、引物NF和NR各1 μL、RNA 模板 5 μL，用 ddH2O 补足至 25 μL。反应条件：50 ℃反转录30 min，95 ℃灭火变性10 min，然后 95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40个循环，最后72 ℃延伸10 min。对扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，用宝生物公司的凝胶回收试剂盒回收N基因片段。

1.3 外源片段与表达载体的连接及鉴定

用HindⅢ和NotⅠ双酶切pNH-MS2his和N基因片段，用胶回收试剂盒回收酶切的pNHMS2his和N基因片段，将回收产物16 ℃连接过夜。连接体系：载体pNH- MS2his和N基因片段分别为 2 μL 和 6 μL，T4 DNA 连接酶 1 μL、10×T4 连接酶缓冲液 1 μL。

将连接产物转化至DH5α感受态细胞；将涂板后获得的重组克隆进行PCR及酶切鉴定；将鉴定为阳性的重组载体命名为pNH-MS2his-N；将阳性克隆保种送上海英骏生物公司测序。

1.4 病毒样颗粒的表达及纯化

将测序正确的pNH-MS2his-N质粒转化表达至菌株BL21（DE3）；将阳性克隆菌株接种于氨苄抗性的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD600=0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导表达6 h，离心收集菌体；在菌体中加入裂解缓冲液重悬，于冰上放置30 min，离心去除菌体碎片；将上清液加入预装有Ni-NTA的纯化柱中，使液体自然流出；加入3倍柱体积的洗涤缓冲液，洗涤2次，然后加入洗脱缓冲液，将病毒样颗粒洗脱。

1.5 病毒样颗粒的鉴定

将纯化的100 μL病毒样颗粒溶液分成2组（实验组和对照组）。对实验组，使用RNeasy Mini Kit提取病毒样颗粒包裹的RNA；对照组不需要做任何处理，即纯化后的病毒样颗粒。将两组均进行100～102倍稀释后，分别使用荧光RT-PCR和荧光PCR检测N基因。

1.6 荧光定量PCR和荧光定量RT-PCR试验

以梯度稀释后的实验组和对照组为模板，按照表1中所列的反应体系和反应条件进行试验。

表1 荧光定量PCR及RT-PCR反应参数

1.7 病毒样颗粒的定值

将纯化的100 μL病毒样颗粒溶液，使用RNeasy Mini Kit提取病毒样颗粒包裹的RNA，使用数字PCR进行RNA定值。反应体系：反转录酶2 μL、反应混合液 5 μL、300 mmol/L DTT 1 μL、VHSV P1 和 VHSV P1（20 mmol/L） 各 0.8 μL、VHSV Probe（5 mmol/L）0.4 μL、 病 毒 样 颗 粒RNA 1 μL，用 ddH2O 补足至 20 μL。

将配好的反应体系加入到DG8 卡夹中，加入微滴生成油，在微滴生成仪中生成微滴；将生成好的微滴转移到96孔板中进行PCR反应。条件如下：60 ℃ 30 min；95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃1 min，40个循环；98 ℃ 10 min；4 ℃保持。反应结束后在微滴读取仪上读取并分析结果。

2 结果

2.1 病毒样颗粒表达载体制备

使用引物NF和NR，从VHSV的基因组中克隆N基因。扩增产物大小约为1 247 bp（图1）。将扩增产物与表达载体pNH-MS2his酶切纯化后进行连接转化；挑取重组克隆，提取质粒，使用PCR和酶切方法进行鉴定（图2），将鉴定正确的重组质粒测序。测序结果表明，克隆获得的N基因序列与NCBI中AB672619.1的同源性达到99%。

图1 VHSV N基因扩增电泳图

图2 pNH-MS2his-N重组质粒的酶切鉴定电泳图

2.2 病毒样颗粒鉴定

使用IPTG诱导表达，利用Ni-NTA Fast Start Kit纯化表达后的病毒样颗粒，对纯化后的病毒样颗粒进行鉴定，分别设立实验组和对照组；使用荧光定量RT-PCR和荧光定量PCR方法进行鉴定。结果显示：在荧光定量RT-PCR试验中，实验组有扩增信号，对照组无扩增信号；在荧光定量PCR试验中，对照组和实验组均无扩增信号（图3）。

图3 病毒样颗粒荧光定量检测

2.3 数字PCR定值

将100 μL病毒样颗粒提取RNA；对RNA使用无RNase的水10倍比系列稀释至107；使用Bio-RAD QX200系统进行定值，发现最低检测限为106稀释度，在106稀释度检测到拷贝数为8（图4）。由此计算得到病毒样颗粒的浓度约为8×106copies/µL。

图4 不同浓度下的病毒样粒子RNA微滴式数字PCR检测结果

3 讨论

Armored RNA技术是根据早期对MS2的研究而衍生出来的。在研究中发现，MS2噬菌体衣壳蛋白能够优先包装含有19mer包装位点的RNA。利用MS2噬菌体的这一特点，将需包装的RNA克隆至MS2噬菌体的19mer包装位点后，即可制备由噬菌体衣壳蛋白包被需包装RNA的假病毒粒子。在以上原理的基础上，实验室制备了能够表达病毒样颗粒的表达载体。将VHSV的N基因序列克隆至表达载体中，通过表达纯化可以得到含有VHSV N基因RNA的病毒样颗粒[7-9]。对纯化的病毒样颗粒进行鉴定，发现对照组中的未处理病毒样颗粒，在荧光定量RT-PCR试验和荧光定量PCR试验中均无扩增信号，而试验组病毒样颗粒经过核酸提取后在荧光定量RT-PCR试验中有扩增条带，在荧光定量PCR试验中无扩增信号。鉴定结果说明，病毒样颗粒成功内包裹了N基因的RNA。

数字PCR技术是一种新型的核酸定量技术。将标准扩增反应体系分布至一定数量的微滴或是芯片的小室中进行PCR扩增，然后收集每个独立的微滴或芯片小室的荧光信号进行计数。该技术无需通过任何标准物或外标，只通过统计学方法计算样本中的核酸拷贝数[10-12]。这种方法具有操作方便、检测通量高、特异性强、灵敏度高、定量准确等优点，已成为分子生物学研究中的重要手段[10]。本研究初步利用数字PCR，对含有VHSV N基因的病毒样颗粒进行定值，计算得到制备的病毒样颗粒为8×106copies/µL。其定值过程包含了RNA反转录及扩增过程，定值结果更加适用于病毒样颗粒作为标准使用。但数字PCR的定值也存在反转录及PCR扩增效率如何体现到最终定值结果中的问题。这将在以后进一步研究。

4 结论

综上所述，含有VHSV N基因的病毒样颗粒具有以下优点：（1）在生物安全方面，由于病毒样颗粒不具备再复制增殖的能力和传染性，因此不会有散毒风险；（2）病毒样颗粒具备病毒的结构，需要进行核酸提取才能扩增，因此可以对RNA病毒检测的全过程进行监控，避免了在核酸抽提过程中出现假阴性；（3）病毒样颗粒具有耐RNase的优点，由此解决了RNA标准样品稳定性的问题。因此，本研究所表达的含有VHSV N蛋白RNA病毒样颗粒在未来的VHSV检测中具有很好的应用前景。

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Construction and Valuation of Virus-like Particles Containing N Gene of Viral Hemorrhagic Septicemia of Salmonids Virus

Wang Qun，Jiang Fan，Yue Zhiqin，Sun Tao，Zheng Xiaolong，Zhang Xiaowen，Fang Baohai

（Technical Center of Shandong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong 266002，China）

To construct virus-like particles（VLPs）standard sample containing N gene of Viral hemorrhagic septicemia virus（VHSV），the N gene of VHSV was amplified by RT-PCR，then the gene was cloned into vector pNH-MS2his contained MS2phage coat protein，and the recombinant prokaryotic expression vector pNH-MS2his-N was constructed.The recombinant plasmid pNH-MS2his-N transformed into E.coli strain BL21（DE3）was induced to expression and purification with 1 mmol/L IPTG. The VLPs were identified and the stability of VLPs was tested by real-time RT-PCR.The concentration of VLPs was valued by digital PCR. The results showed that the VLPs contained N gene RNA and had good stability. The concentration of VLPs was 8×106copies/mL. The results showed that the VLPs could be used as a standard and quality control in RNA virus detection.

Viral hemorrhagic septicemia virus（VHSV）；virus-like particles（VLPs）；N gene；digital PCR

“十二五”国家科技支撑项目（2013BAD12B02-03）

S852.65

A

1005-944X（2018）01-0100-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2018.01.027

朱迪国）